多肽纯化中的常见问题-一定要了解
1、检测肽纯度的一般方法是什么?
它通常由高效液相色谱法(HPLC)测定。
2、肽含量和肽纯度有什么区别?
肽不仅包含正确的肽,还包含杂质,例如生产中的水和有机盐。肽纯度是指相对于所有杂质(水分除外)正确肽的数量。然而,肽含量是目标肽相对于样品中其他所有物质的百分比,通常由 N 元素分析和氨基酸分析确定。因此,即使肽纯度达到99%,考虑到水和有机盐,含量仍可能为70%-80%。
3、肽分离纯化最常用的技术是什么?
最常见的技术是反相高效液相色谱 (RP-HPLC)。
4、RP-HPLC 中通常使用哪种流动相进行肽分离和纯化?
最常见的流动相是水和乙腈,三氟乙酸充当离子对试剂。根据不同的肽段,采用合适的梯度洗脱进行分离。
5、为什么在流动相中添加 TFA 作为离子对试剂?是否有任何其他流动相或离子对试剂可用于肽分离和纯化?
TFA可用于调节流动相的pH值,作为离子对试剂与多肽相互作用,增强分离效果,显着改善峰形。
其他用于多肽分离纯化的流动相或离子对试剂包括乙酸体系、磷酸体系、盐酸体系、七氟丁酸等,可通过调节pH达到很好的分离效果。
6、如何溶解多肽?
大多数肽可以溶解在超纯水中。对于一些不溶性肽,需要先分析氨基酸序列。酸性肽可先溶于少量碱性溶液(如0.1%氨水),然后稀释至所需浓度。作为碱性肽,可溶于少量酸性溶液(如乙酸、三氟乙酸),然后稀释至所需浓度。对于疏水肽,可溶于强极性有机溶剂,如DMF、甲醇、丙醇、异丙醇、DMSO等。
7、RP-HPLC中常用的色谱填料有哪些?
最常见的填料是 C18、C8 和 C4 反相色谱柱。
8、纯化中如何选择色谱填料?
不同序列的肽在理化特性和疏水性方面表现出很大差异。在大多数情况下,C18 色谱柱对分子量小于 4000 或亲水性的肽段的分离效果最好。C4 柱适用于分子量超过 5000 或疏水末端。C8列介于C18和C4之间,其效果更类似于C18。对于一些特殊的选择性肽段,也可以选择苯基柱和聚合物柱。
9、纯化中选择聚合物填料的原则是什么?
当需要更高的 pH 或温度时,具有宽 pH 范围的聚合物 HPLC 柱可能适用于纯化。它们在极端pH条件下不会降解,因此可以使用强酸和强碱作为流动相进行分离和纯化。
10、什么会影响多肽纯化的结果?
影响因素很多,主要包括流动相、色谱柱类型、柱温、波长、色谱仪性能等。这些差异可能会导致最终结果出现错误。
11、频繁的基线漂移可能是什么原因?如何解决?
反相分离中基线漂移的主要原因是固定 TFA 浓度的梯度洗脱会导致 210-220 nm 处的吸收基线发生偏移。建议使检测波长尽可能接近215 nm,以减少或消除TFA吸收光谱变化对基线漂移的影响。此外,与溶剂 B 相比,溶剂 A 中添加的 TFA 减少 15% 可以补偿基线漂移。例如,如果溶剂 A 中的 TFA 浓度为 0.1%,则建议溶剂 B 中添加 0.085%。
12、反相色谱纯化后,如何从最终产品中去除流动相中的TFA、乙腈等杂质?
只要不超过耐受范围,冻干可能是去除大部分 TFA 和乙腈的最简单和最有效的方法。但该方法不能满足一些对TFA含量要求较高的多肽类药物的要求。应与它们进行特殊的盐转化和脱盐。
13、肽的一般盐形式有哪些?如何转换盐形式或脱盐?
大多数肽在TFA系统下纯化,因此TFA盐是最常见的形式,其次是乙酸盐和盐酸盐形式,很少有肽药物是特殊盐形式。离子交换和 HPLC 是最常用的盐转化方法,而 G25(GE Healthcare 的葡聚糖凝胶)柱可用于脱盐。
14、TFA 是否仅用于调节缓冲液中的 pH 值?TFA 浓度越高,基线漂移越严重。这是否意味着如果缓冲液的 pH 值允许,TFA 的浓度越低越好?
TFA可以作为离子对,浓度通常在0.05-0.1%左右。浓度过高会使溶液过酸,影响色谱柱的使用时间。
同时,TFA 可以抑制硅胶表面的硅烷醇基团,改善碱性化合物的峰形。如果使用 0.1% TFA 有时分离效果不好,可以尝试 0.2% TFA,但使用后需要立即冲洗色谱柱。
在梯度洗脱时,由于基线漂移,它对制备的影响很小。
15、为什么肽样品需要在上样柱前进行预处理?有哪些制备方法?
制备柱更容易被污染,因为与分析柱相比,它们处理的样品更多。因此,需要对样品进行预处理以延长色谱柱的使用时间。主要有五种方法:过滤、离心、柱前过滤和在线过滤。
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