多肽合成中的常见问题-值得了解

1、肽合成的基本原理？

固相肽合成是肽合成化学的重要突破。其主要特点是无需纯化中间产物，合成过程可以连续进行，为多肽合成的自动化奠定了基础。目前多肽的全自动合成基本上是固相合成。基本流程如下，

基于Fmoc化学合成，将目标肽C端氨基酸的羧基与不溶性聚合物树脂共价连接，然后以该氨基酸的氨基为起始点合成肽，形成肽与其他氨基酸的活化羧基结合。重复此过程即可获得肽。根据肽的氨基酸组成不同，肽的后处理方法不同，纯化方法也不同。

2、生产肽的常用方法有哪些？

线性肽的肽链采用Fmoc固相合成法延长，氨基酸从C端到N端逐步连接。开始时，第一个氨基酸通过酸敏感接头连接到不溶性支持树脂上。用六氢吡啶除去 Fmoc 保护基后，连接第二个 Fmoc 保护的氨基酸。连接方式包括预激活或“一锅”等。连接目标序列后，用TFA将肽链从树脂上洗脱下来，得到粗品。

3、不同实验如何选择肽的纯度？

肽的纯度是一个很重要的指标，纯度的选择取决于实验的目的。对于敏感性较低的筛选试验，建议使用粗品或> 75%，对于免疫水平，建议使用> 85%。对于受体-配体相互作用研究、生物测定或细胞水平研究，推荐值 >95%，对于结构研究，推荐值 >98%。

4、什么是肽的净含量（肽含量），它的意义是什么？

干肽的重量不仅含有肽，还含有一些非肽成分，如水、吸收的溶剂、配位离子和盐。肽的净含量是指其中肽的重量百分比。该百分比的值可以在 50% 到 90% 的范围内，具体取决于纯度、序列以及合成和纯化。不要将肽的净含量与肽的纯度混淆。它们是两个完全不同的概念。纯度通常由 HPLC 测定。纯度定义为肽样品中序列正确的组分的百分比，而肽的净含量是指样品中肽物质相对于非肽物质的百分比。肽的净含量通常通过氨基酸组成分析或紫外分光光度法测定。在某些对肽浓度敏感的实验中，该信息对于计算肽浓度非常重要。

5、如果肽纯度为 95%，剩下的 5% 是多少？

肽的纯度通常由 HPLC 测定，标准乙腈梯度为每分钟 1%。在合成过程中，氨基酸之间的交联效率并不总是达到100%，从而产生了一系列氨基酸缺失杂质。这些氨基酸缺陷杂质大部分在纯化过程中被去除，但其色谱性能与目标肽非常相似。这些氨基酸缺失在剩余的百分之几中保留在肽样品中。

6、非 HPLC 纯化肽中存在哪些杂质？

粗品级和脱盐级中的肽和非肽杂质：如非全长肽和一些肽后处理原料如DTT、TFA等。

7、多长的肽段合适？

肽合成需要考虑肽的长度、电荷和疏水性等因素。长度越长，粗品的纯度和收率越低，提纯难度越大，合成失败的概率越大。当然，多肽功能区的序列是不能改变的，但为了多肽的顺利合成，有时需要在功能区的上下游添加一些辅助氨基酸，以提高多肽的溶解度和亲水性. 如果肽段太短，合成可能会出现问题。主要问题是合成的肽在后处理过程中存在一定的难度。5肽以下的肽一般需要疏水性氨基酸，否则后处理比较困难。

8、如何从肽序列中确定肽的溶解度？

如果肽中含有高比例的疏水性氨基酸，如 Leu、Val、IIe、Met、Phe 和 Trp，则很难溶解在水溶液中或根本无法溶解。这些氨基酸，无论是纯化的还是合成的，可能有问题。

一般疏水氨基酸比例<50%，连续5个氨基酸不能疏水，带电荷氨基酸比例（正电荷K、R、H、N端，负电荷D、E、C端) 达到 20%，在肽 N 或 C 中，如果可以增加极性氨基酸，也可以提高溶解度。

9、为什么合成含有 Cys、Met 或 Trp 的肽很困难？

合成含有Cys、Met或Trp的肽并获得高纯度产品是困难的。主要原因是这些基团不稳定，容易氧化。应特别注意这些肽的使用和储存，避免重复打开盖子。

10、为什么某些肽的合成收率或纯度较低？

肽合成和引物合成有比较大的区别。不能合成的引物很少，但往往有不能合成的肽。由于Val、Lle、Tyr、Phe、Trp、Leu、Gln、Thr是直系同源或重复的氨基酸，在合成过程中肽链不能完全溶解，合成效率降低。在以下情况下，产品的合成效率和纯度都比较低，如：重复pro、Ser-Ser、重复ASP、四连续Gly等。

11、如何纯化肽？

通过反相柱（如C8、C18等）在214 nm处纯化肽。缓冲系统通常是含有 TFA（pH 值为 2.0）的溶剂。缓冲液 A 在 ddH 2中含有 0.1% TFAO, 缓冲液 B 含有 1% TFA / ACN / ph2.0。Buffer A 用于在纯化前溶解肽；如果溶液不好，用Buffer B溶解，再用Buffer A稀释。对于强疏水性肽，有时需要添加少量甲酸或乙酸。多肽粗品的HPLC分析，如果多肽不长（15aa以下），一般会有一个主峰，主峰通常是全长产物；对于20aa以上的长肽，如果没有主峰，HPLC需要匹配质量确定分子量，然后确定哪个峰是要合成的肽。

12、适合免疫的肽多长时间？

一般约为10-15个氨基酸。当然氨基酸数量越多，免疫效果越好，但合成费用也会增加。然后预计映射肽的长度将超过 15 个氨基酸。此外，10个氨基酸以下的肽在免疫方面的效果较差。

13、肽的外观是什么？

肽是粉末状的，通常是白色的。肽粉的颜色随着成分的不同而不同，比如一些带有FITC修饰的黄绿色。

14、如何溶解多肽？

溶解多肽非常复杂，通常很难一次确定合适的溶剂。一般是先取一点进行试验，不要完全溶解后再确定合适的溶剂。

以下方法可帮助您选择合适的溶剂：

确定肽的比电荷，将酸性氨基酸ASP（D）、Glu（E）和C端COOH设置为-1；碱性氨基酸Lys(K)、Arg(R)、His(H)和N端NH2为+1，其他氨基酸的电荷为0。计算电荷数。

如果净电荷数 > 0，则肽呈碱性，用水溶解：如果不溶或不太溶，加入乙酸（10% 以上）；如果肽尚不溶解，则加入少量 TFA（25 ul）溶解，然后加入 500 ul 水稀释。

若净电荷数<0，肽呈酸性，溶于水；如果不溶解或不太溶解，加入氨水（25 ul）溶解，然后加入 500 ul 水稀释。

如果净电荷数=0，肽是中性的，一般需要用乙腈、甲醇或异丙醇、DMSO等有机溶剂溶解。也有人提出需要尿素来溶解疏水性强的肽.

15、如何储存合成肽？

多肽长期保存一般需要避光保存，短期保存应在–20℃和4℃保存。肽可以在室温下短时间运输。肽在-20℃下是稳定的，尤其是冷冻干燥并储存在干燥器中。冷冻干燥的肽在暴露于空气之前可以在室温下储存。这将减少湿度的影响。当无法进行冻干时，最好的方法是少量储存样品。

对于含有 Cys、Met 或 Trp 的肽，脱氧缓冲液对于它们的溶解是必不可少的，因为这些肽很容易被空气氧化。在封端之前缓慢流过肽的氮气或氩气也可以减少氧化。含有 Gln 或 Asn 的肽也很容易降解，与没有这些问题和简单肽的肽相比，所有这些肽的寿命有限。

16、如何处理肽的两端？它是免费的还是受保护的？

肽用于模拟蛋白质。为了模拟蛋白质的表达，我们需要合成与蛋白质具有相似结构和电荷的肽。当一个肽从蛋白质中“切出”时，两端的电荷数将与基因体蛋白的电荷数不同。我们需要改变合成策略以使它们保持一致。一般来说，如果来自蛋白质的C端，N端被乙酰化屏蔽；如果它来自蛋白质的N端，则C端被酰胺化屏蔽；如果它来自蛋白质的中间部分，则两端被乙酰化和酰胺化屏蔽。

17、什么是电喷雾电离质谱（electrospray ionization，EIS）？

EIS可以产生多价离子化的蛋白质或多肽，可以分析相对分子量为1×10 5的蛋白质，分辨率为1500-2000 amu。准确率约为 0.01%。EIS 更适用于高分子量蛋白质的在线分析，需要气化或有机溶剂对样品进行敏化。

18、什么是基质辅助激光解离/电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)？

MALDI-TOF是目前蛋白质鉴定中准确测定分子质量的一种手段，特别适用于测定混合蛋白肽种类的相对分子质量，具有良好的灵敏度和分辨率。它是当前蛋白质组学研究的必备工具。一种与液相色谱同时结合的联用技术可以高效地鉴定肽种类。尤其是当质谱技术的各种原理串联应用时，不仅可以获得肽的相对分子质量信息，还可以确定其序列结构，该技术将在未来的蛋白质组学研究中具有决定性意义。

19、什么是高效液相色谱（HPLC）？什么是反相高效液相色谱 (RP-HPLC)？

高效液相色谱的出现为多肽的分离提供了一种有利的方法。与其他化合物相比，在合适的色谱条件下，蛋白质和多肽的分离可以在短时间内完成。更重要的是，高效液相色谱法可以大规模生产生物活性肽。因此，许多学者为寻找多肽分离制备的最佳条件做了大量工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析确定是目前的研究内容。

反相高效液相色谱（RP-HPLC）：结果与保留值的关系：用RP-HPLC分离肽，需要确定不同结构的肽在柱上的保留。为了获得一系列保留系数，Wilce 等人。采用多元线性回归法分析了2106种多肽的保留性质和结构，得到了不同氨基酸组成与保留系数之间的关系。可减少2-20个氨基酸肽中极性氨基酸残基的保留时间；在10-60个氨基酸肽段中，更多的非极性氨基酸也可以减少在柱上的保留时间，而在5-25个氨基酸肽段中，更多的非极性氨基酸可以延长在柱上的保留时间。

20、为什么在 RP-HPLC 中使用梯度洗脱？

目前，RP-HPLC是研究多肽相关物质合成最常用的方法。但由于合成多肽中相关物质的性质不同，单纯的等度洗脱法难以全面检测产品中的各类有机杂质。

21、质谱中如何确定单同位素峰和平均同位素峰？

在低分辨率的质谱中，显示的峰通常是平均同位素峰。然而，质谱（如MALDI-TOF）的分辨率非常高。一般的小分子（如肽段）常含有4-5个同位素峰，其中分子量最小的是单同位素峰。使用质谱法检测大分子（如完整蛋白质）时，同位素峰的数量非常多，在图谱上难以区分。在这种情况下，使用平均同位素峰更有意义。

22、同位素峰之间是否有 1 Da 的差异？

同位素肽的质量（m）一般相差1 Da，但质谱检测到的峰是肽的质荷比（m/z）而不是质量本身，当肽的质荷比差异小于1时有多项收费。如果检测到的肽带一个电荷，则同位素峰之间的差值为 1；如果检测到的肽段有两个电荷，则同位素峰之间的差值为 0.5；如果检测到的肽段带三个电荷，则同位素峰之间的差值为 0.33；等等。因此，从同位素峰之间的距离，我们可以推断肽的带电状态（z），从而推断肽的单个同位素质量[（m/z）*z]。

23、单同位素峰一定是最高的吗？

单同位素峰必须在一组峰中具有最低的质荷比，但不一定是最高的。当肽的分子量较小时，肽中的原子总数也较少，整个肽含有同位素原子的概率较小。此时，单同位素峰往往是最高峰。当肽的分子量增加时，携带同位素原子的概率增加。在这种情况下，+1 Da 甚至+2 Da 的同位素峰可能是最高的。统计结果表明，当多肽的分子量大于2500 Da时，该峰不是单同位素峰。

24、除了 HPLC 和 MS，还有哪些其他肽分析方法可用？

还可提供水馏分、离子色谱、元素分析、氨基酸组成分析、圆二色谱、NMR、IR、UV、内毒素、微生物等分析。

25、肽通常携带的抗衡离子是什么？

多肽冻干粉一般配三氟乙酸盐，如果是做细胞实验或动物实验，建议换成乙酸盐或盐酸盐。

26、可以提供哪些同位素标记的肽？

可以提供一些稳定的同位素修饰肽，主要包括N15、C13和氘修饰。由于稳定同位素氨基酸原料价格昂贵，建议选择一些简单的氨基酸进行标记，如Gly、Val、Phe、Leu、Ala等。

27、影响多肽稳定性的因素有哪些？

影响合成肽稳定性的因素包括脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋化、β-消除、聚集等。合成肽最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物和水解产物。在各种氨基酸中，天冬酰胺和谷氨酰胺容易脱酰胺（特别是在高pH和高温下）；蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸最容易被氧化，对光敏感；天冬氨酸形成的肽链容易断裂，尤其是ASP-Pro和ASP-Gly肽键。肽的聚集主要是由疏水相互作用引起的。虽然目前很难准确预测哪些肽段容易聚集，至少对于一些中长肽段来说，

28、Fmoc/tBu固相合成（SPPs）如何选择树脂？

C端羧肽合成可选用Wang树脂；对于C端酰胺肽的合成，可选择Rink Amide AM Resin或Rink Amide MBHA Resin；对于全保护肽的合成，我们可以选择2-Cl Trt Resin。

29、树脂的参数是什么？参数的含义是什么？

一般树脂的参数包括载量、目数和规格，如1% DVB。

载量：单位为mmol/g，即每克树脂存在多少毫摩尔官能团。

目数：粒度一般为100-200目，数值越大，颗粒越细。

1% DVB：交联剂二乙烯基苯在苯乙烯和二乙烯基苯共聚物中的比例。

30、Fmoc保护氨基酸树脂的负载量计算方法有哪些？

Fmoc保护氨基酸树脂载量的计算一般有两种方法，一种是增重法，增加的重量除以分子量，再除以树脂的总重量。另一种是通过紫外分析。目前我司提供UV分析加载值。

31、什么样的肽可以通过紫外分析来计算肽含量？

如果肽段序列中含有Trp或Tyr，可用紫外法分析肽段的含量，根据摩尔消光系数：

色氨酸 5,560 AU/mmole/ml

酪氨酸 1,200 AU/mmole/ml

（280 nm at 中性pH使用 1 cm 比色皿）

肽的摩尔消光系数可以根据每个色氨酸或酪氨酸的系数相加，然后根据在 280 nm 处测得的吸光值按公式计算。

mg 肽/ml = (A280 x DF x MW) / e

A280，280 nm 处的实际吸收值（1 cm 池），

DF，稀释因子，

MW，肽的分子量

e，肽的摩尔消光系数

32、肽与其他化合物或载体的结合应考虑哪些因素？

一些肽往往需要与一些具有特定功能的药物或化合物，或一些载体连接。这些过程需要化学键结合。通常，当肽具有氨基或羧酸官能团时，可以考虑相应的羧酸或氨基进行缩合。另一种选择是在 pH 8 的环境中将马来酰亚胺与硫醇连接。肽可以用 Cys 或马来酰亚胺官能团进行修饰。马来酰亚胺改性通常可以通过 3-马来酰亚胺丙酸 (CAS 7423-55-4) 实现。

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