《Protein Actions Principles and Modeling》-《蛋白质作用原理和建模》中文分享（7）
《Protein Actions Principles and Modeling》-《蛋白质作用原理和建模》
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第三章：Proteins Have Stable Equilibrium Conformations
（蛋白质具有稳定的平衡构想）
-天然状态和变性状态是蛋白质的稳定状态
稳定的平衡构象是蛋白质的一个重要特征。蛋白质在给定的天然条件下具有特定的天然结构，并且在给定的变性条件下具有特定的变性结构。这样的结构变化不依赖动力学过程实现。因此，只要蛋白质处在同一环境下，在细胞中的核糖体上折叠的蛋白质与在试管中折叠的蛋白质处于相同的构象状态。这意味着蛋白质性质通常可以通过平衡热力学来表达，而不需要路径信息。但是，有一些例外。蛋白质晶体或聚集体的结构有时取决于初始条件或它们形成的速度。在这里，我们仅探索蛋白质的一些稳定状态以及维持它们的因素。
蛋白质稳定性很重要，原因有几个。细胞能维持蛋白质稳态（即一个细胞中所有蛋白质或蛋白组的折叠稳态）。当面对蛋白质降解或错误折叠和聚集的情况时，细胞已经会利用一些复杂的机制来维持和调节蛋白质稳定性和构象平衡。这些机制包括了使用伴侣（帮助其他蛋白质折叠的蛋白质），蛋白酶，蛋白酶体以及控制蛋白质合成和降解率。蛋白质的稳定性也是淀粉样蛋白和其他疾病如衰老和癌症的影响因素。其次，蛋白质稳定性可以用于深入了解蛋白质折叠的力量。第三，在开发生物技术治疗（蛋白质药物）时，必须了解规定蛋白质折叠，降解，聚集，溶解，结晶和原纤化的溶液条件。
在生物条件下，蛋白质通常是折叠的或天然的。在恶劣条件下-在酸或碱中，在高温下或在化学变性剂中-蛋白质可以展开或变性。蛋白质结构的变化是可逆的或不可逆的。可逆意味着如果你使蛋白质偏离其初始状态-即使产生大的变化-你可以通过重新建立初始条件，使蛋白质将返回其初始的构象状态。而找到可逆性变性的优点是可以使用平衡热力学来解释现象。
蛋白质的某些转化是不可逆的。例如，高温可以通过水解谷氨酰胺和天冬酰胺的酰胺侧链基团，去除NH2基团并将剩余的侧链转化为谷氨酸或天冬氨酸来共价降解蛋白质。蛋白质骨干可以被蛋白酶共价降解。共价降解是不可逆的，因为在共价键断裂后降低温度或去除蛋白酶不会使蛋白质恢复到其原始结构。
在高浓度下，蛋白质可以可逆或不可逆地结晶或聚集。蛋白质之间的不可逆聚集可能来自蛋白质之间的共价结合，例如通过二硫键形成，或者当链变得高度缠绕以至于它们不能在实验时间尺度上彼此分离时。在本章中，我们专注于可逆过程。
直到20世纪60年代，蛋白质是否可以可逆地折叠和展开是一个重点研究的问题。以前，蛋白质科学因无法纯化蛋白质而受到阻碍。实验主义者经常无意中研究了不可复制的过程，如聚合。目前尚不清楚蛋白质结构是热力学稳定的物质状态。Christian B Anfinsen在20世纪60年代早期对牛胰腺核糖核酸酶A的实验首次证明折叠是可逆的，并且蛋白质的天然状态在热力学上是稳定的。Anfinsen破坏了天然二硫化物键，使蛋白质变性，然后重新建立了天然条件，并发现蛋白质正确地重新折叠。当时，二硫化物结合是选择的方法，因为二硫化物是可捕获且可识别的。他的工作，他获得了1972年诺贝尔化学奖，表明蛋白质的天然结构可以完全编码在其氨基酸序列中（即，它是热力学稳定的），因此成功的折叠不需要特殊的动力学信息。也就是说细胞中的蛋白质折叠可以由其他分子辅助完成。例如，已知一些蛋白质经历共翻译折叠；它们的折叠发生在它们被核糖体释放时，即边翻译边折叠。并且，许多蛋白质的折叠通常是在称为伴侣的蛋白质类的帮助下在体内进行，这有助于其他蛋白质在细胞内折叠并防止它们的错误折叠和聚集。然而，许多小的单域蛋白在试管中常规展开和可逆地重新折叠，没有生物辅助分子。因此，蛋白质的天然结构是稳定的平衡状态。
测量蛋白质稳定性的基本实验是平衡变性。你配制了一系列不同的蛋白质溶液，1，2，...，M，并且具有不同数量的变性剂x1，x2，...，xM。通过“变性剂”，我们指的是温度或化学物质，例如盐酸胍（GuHCl），尿素，酒精或酸或碱。然后，在每个具有特定量x的变性剂溶液，，可以计算出（通常通过某种形式的光谱学）天然蛋白质分子的比例fN(x)和变性蛋白质分子的比例fD(x)=1-fn（假设只观察这两种状态，这是一种常见的情况）。增加变性剂增加D相对于N的数量。在没有变性剂的情况下，蛋白质是完全天然的（波动除外）。在高浓度的变性剂中，蛋白质变性。图3.1 a显示高温变性；图3.1 b显示了高浓度尿素的变性。作为变性剂x的函数，称为熔化或变性曲线的这种图通常是Sigmoid形状。在中点，变性浓度的微小变化会改变蛋白质构象的分布。从这个意义上说，蛋白质变性是较大系统中相变的小型化版本；例如，在正确的温度下，温度的微小变化会导致水沸腾或冻结。
图3.1 蛋白质因温度升高或变性浓度而变性。(A)核糖核酸酶A的热变性，如通过光谱和粘度测量确定的。(B)如通过光谱法测定的核糖核酸酶T1的尿素诱导的变性。
要想了解变性的概念，那么必须先了解什么是自由能。自由能分为两种吉布斯自由能G和亥姆霍兹自由能F。F在如何处理压力-体积效应上与G不同。压力-体积变化对于气体或气液系统来说可能很大，对于蛋白质溶液来说通常很小。所以焓H和内能U是等价的，即H≈U。吉布斯自由能G(T,P,N)=H-TS≈F(T,V,N)=U=TS等价于亥姆霍兹自由能F。实验研究通常报告自由能G和焓H。自由能G可用于表示折叠自由能。将蛋白质从其变性状态(D)折叠到其天然状态(N)，其自由能的变化ΔGfold = GN-GD.此外，天然状态的比例(fN)和变性状态(fD)的比值可作为折叠平衡常数K,其方程式为
而折叠自由能的方程可以定义为
其中T是绝对温度（以开尔文为单位），R是气体常数。而展开的自由能计算则为ΔGunfold =-ΔGfold。
图3.2 使用式3.1和3.2.（A和B）的变性曲线可以确定折叠自由能。尿素或GuHCl等变性剂的自由能依赖为线性(C)，因此在没有变性剂的情况下可以推断ΔGfold。相反，具有温度依赖性的(D)是弯曲的。
图3.2 A说明化学变性，图3.2 C显示折叠自由能ΔGfold(c)和GuHCl变性剂浓度c的相互关系。ΔGfold(c)几乎与c呈线性相关。ΔGfold(c)与浓度c的斜率为m。
加热也是一种使蛋白质变性的方法（见图3.2B）。ΔGfold(T)通常是温度T的曲线函数（见图3.2D）.您可以在量热计中测量蛋白质的性质作为温度的函数。差示扫描量热计将一系列不同的温度应用于平衡的蛋白质溶液.量热计测量蛋白质溶液在每个温度下吸收或释放的热量。随着温度的上升，蛋白质会不断地吸收热量直至展开。而开始变性的温度Tm称为熔化温度或变性温度-是蛋白质变性转变的中点。蛋白质展开过程中的过量热量：展开的热量变化减去纯溶剂的热量变化。作为实际问题，可以通过减去斜率基线或积分获得焓并找到斜率来获得变性点ΔCp=dH/dTm。
热量实验表明，蛋白质变性类似于熔化过程。在其熔点，因为键的断裂，材料的能量和熵都随着温度急剧增加。类似地，在热变性的中点温度下，蛋白质的能量和熵也会急剧增加。增加的能量表明一些链内相互作用被破坏，增加的熵表明系统获得了构象自由。为了更深入地探索这一点，我们现在进行建模。要做到这一点，我们需要热力学和统计力学的语言，我们稍后会对此进行评论。但首先，让我们看看如何从实验变性曲线转换为自由能。从ΔGfold(T)的温度依赖性中，您可以通过热力学关系获得两个分量量：折叠时焓的变化，ΔHfold(T)和折叠时熵的变化，ΔSfold(T)。
其中ΔGfold(c)和ΔGfold(T)曲线能够更好地理解驱动蛋白质构象变化的作用力。
首先，我们先了解一下蛋白质的天然构象然后来理解稳定其构象的作用力。蛋白质的具有紧凑的天然构象并且其中心大多数是疏水性的，而这意味着疏水作用力在蛋白质折叠中的相互作用。让我们回顾一下蛋白质的二级结构α-螺旋和β-折叠。他们的一个重要特点就是具有氢键。蛋白质的良好结构与范德华力也有密切的关系。一些天然蛋白质还有盐桥结构：其中一个带正电荷的原子位于一个带负电荷的原子附近通过静电吸引力而保持稳定。但是如果充分地了解蛋白质的稳定性结构，但单单看天然结构所表示的东西是不够的。链熵的变化就可以很大，但是其无法直观地在结构上观察到。这个时候，我们可以尝试使用统计力学模型来深入了解熵。
图3.4 基于它们在链序列中的分离程度，相互作用分为为局部和非局部。
首先，我们学习一下局部作用和非局部作用这两个概念（图3.4）。局部作用指的是那些在蛋白质链上靠的很近的氨基酸的相互作用，如在螺旋和turn中。非局部相互作用是指链序列中距离较远的氨基酸之间的相互作用，如β-折叠。例如，当两种油样氨基酸取代水相互接触时，就会形成非局部的相互作用。蛋白质的稳定性来自于这两种类型的相互作用。局部分离与非局部分离是指接触单体之间的链分离的术语，可以区分为短程与长程，指相互作用单体之间通过空间的距离。库仑相互作用在空间中是长距离的（能量取决于距离r的1/r），范德瓦尔斯吸引在空间中是短距离的（取决于1/r6）。这里简要总结了蛋白质中非共价键相互作用的类型。
疏水效应是指油水和水分离的趋势。20种氨基酸侧链中，大约有一半具有油状或非极性的特征。在蛋白质的天然结构中，蛋白质的非极性氨基酸往往被埋在其核心内，这意味着至少在一定程度上是由蛋白质的折叠收到了非极性氨基酸躲疏水倾向的影响。这里有两个迹象表明了疏水相互作用在蛋白质折叠中的重要性：(1)蛋白质被溶剂展开，如GuHCl、尿素、醇和表面活性剂，它们削弱了蛋白质折叠的疏水驱动力，(2)对于典型的小蛋白，有一个很大的展开热容量，ΔCp.unfold>0。较大的正热容是简单系统中疏水效应的一个特征。疏水相互作用的一个特征指纹是，非极性分子，如苯、甲苯或烷烃，从其纯液态向水溶液的变化会增加热容量。ΔCp=Cp,with solute-Cp,without solute(表3.1)
表3.1 在23◦C时，非极性分子向水中的转移是不利的（自由能为正的），以熵为主，并与热容的正变化有关。
疏水效应是水-水氢键作用的结果。粗略地说，两个水分子之间的氢键很强，所以水分子倾向于在溶质周围配置，以最大限度地增加它们与其他水分子的氢键。换句话说，两个放入水中的非极性分子会相互结合，以减少它们暴露在水中的程度，从而最大限度地增加水与水之间的氢键。疏水性尺度近似表示了不同类型的分子从水分裂为油样环境的相对趋势。图3.5显示了两疏水尺度表。
图3.5 氨基酸的两种疏水性尺度。一个5分子肽在中间位置有20种不同的氨基酸中的一个。肽从水中到(A)一脂质双层界面或(B)辛醇介质。橙色的条表示相对于水的（疏水）残留物，绿色的条表示有利于生活在水中的（带电和极性）残留物。水平虚线表示肽键对所有氨基酸的贡献。组氨酸(H)显示了两次，因为它具有带电和不带电的形式（带电的形式在左边）。
根据油的类型和测量条件，氨基酸有许多不同的疏水性尺度。一般来说，在一个尺度上登记为疏水的分子在其他尺度上趋向于登记为疏水，但在不同尺度之间存在差异。3.6说明了疏水性尺度的一个应用；它表明，蛋白质序列中的疏水氨基酸串可以识别膜蛋白的跨膜部分。
图3.6 水性图确定了定义膜蛋白跨膜区域的疏水序列。亲水性图使用疏水性尺度来显示疏水性作为序列位置的函数。橙色表示疏水区域，而绿色表示极性或带电区域。（A)细菌视紫质有7个跨膜的α-螺旋，对应于(B)在亲水性图中的7个橙色峰。
当氢键供体基团（如酰胺，−-N-H）与接受基团（如羰基氧，O==C-）共享其氢时，会形成氢键，如−-N-H···O==C-。氢键在天然蛋白质结构中广泛存在，主要在骨干羰基和酰胺中，特别是在a-螺旋和b-折叠中。突变研究以及使用渗透压剂如三甲胺N-氧化物（TMAO）的实验，表明氢键对蛋白质稳定性的贡献在0.3至1.5kcal/mol之间，虽然令人怀疑的是蛋白质中是否存在“平均”氢键。氢键的强度在很大程度上取决于它们的环境。在真空中，氢键可以达到5至10kcal/mol。在蛋白质中，“氢键强度”是指天然蛋白质中氢键的自由能与变性状态中氢键的自由能之间的差异，而这些蛋白质通常在水分子的包围中。氢键具有显着的静电特性。因此，它们在介电常数低（估计为2-12）的油状环境（如蛋白质内部）中比在介电常数高（约80）的水状环境中更强。
氨基酸紧密包装在天然蛋白质核心中。这样的紧密包装结构主要受到范德华相互作用的影响。范德华力是（1）将原子聚集在一起的短程吸引力，以及（2）在更短程的排斥力，防止两个原子占据同一空间。范德华吸引力和排斥力在很大程度上影响蛋白质核心中氨基酸的紧密空间结合。突变研究表明，有效填充空间的趋势与疏水相互作用一样强。例如，在空腔中添加甲基使蛋白质稳定约0.9kcal/mol。
紧密包装并不困难。在罐子里摇动坚果和螺栓，它们也会很好地包裹。有趣的是，蛋白质内部填充的空间比例约为74%，这与相同球体的最大密度包装大致相同。白质内部怎么会如此密集？事实证明，通过将小的，大的和不规则的物体混合在一起，你有时可以通过有效地填充角落和缝隙来更紧密地包装空间使其填充率超过74%。例如，想想大理石如何填充包装良好的保龄球之间的小空间。类似地，，氨基酸通过它们不同的大小和形状，也可以很好地填充空间。在下面的文本中，我们描述了这些不同类型的力如何有助于蛋白质稳定性。
为了了解这些力如何有助于蛋白质折叠和展开，我们从几个基本前提开始。首先，蛋白质是链分子。链分子可以采用许多不同的构象，因为不同的骨干扭转态通常具有相似的能量。此外蛋白质的变性构象比原生构象多得多。也就是说，蛋白质通过展开到大量变性构象来增加链熵。第二，天然结构通过链内相互作用稳定，其中包括范德华，氢键合，静电和疏水相互作用。第三，侧链交互在折叠代码中起着与主干交互不同的作用。主干相互作用无法解释折叠原理，因为所有蛋白质具有相同的主干原子：溶菌酶由于其不同的侧链序列而与核糖核酸酶折叠不同。此，为了解释蛋白质折叠原理，我们关注解释蛋白质内部的疏水相互作用。电荷相互作用也编码在侧链中，但大多数蛋白质中的电荷相互作用相对较少，并且它们往往位于蛋白质表面，主要是在水中，在那里它们相互作用很弱。第四，蛋白质折叠过渡的尖锐性是球状蛋白质的一个近乎普遍的特征。在讨论折叠物理学之前，我们首先简要回顾统计力学，主要是玻尔兹曼分布定律的内容。
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下次见！
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