前情提要： [软件使用 3] 使用MACS2分析ChIP-seq数据，快速入门！

详细讲解了ChIP-seq的一些基本概念、数据的下载和处理，并且也用 ChIPseeker 初步画图。

本文主要讲述如何用 Deeptools 对 ChIP-seq 数据进行图形呈现：

一、基本概念
1.1 Deeptools 的用途
1.2 TSS
1.3 BED 格式二、画图
2.1 ComputeMatrix
2.2 plotHeatmap 绘制热图
2.3 plotProfile 绘制折线图

一、基本概念

1.1 Deeptools 的用途

1. 处理 bam 文件 或者 bam 转化的 bigwig 文件；
2. 数据质量控制；
3. 作图，比如热图、折线图；
4. 其他。

1.2 TSS

转录起始位点（Transcription Start Site, TSS）：是指一个基因的5'端转录的第一个碱基，它是与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为一个嘌呤（A或G）。

通常把转录起始位点前即5’末端的序列称为上游，而把其后即3‘末端的序列称为下游。

知识点：转录起始位点是指一个基因的5'端转录的第一个碱基。

需要区分 TSS 和启动子~

了解更多：转录起始位点是启动子吗？

1.3 BED

BED (Browser Extensible Data)是一种灵活的储存数据的格式，主要用来储存基因组特征（genomic features）或注释信息。

了解更多：[生信资料 3] 生物信息学常见数据格式，汇总！

二、画图

思路：

• 首先，用 ComputeMatrix 计算全基因组范围内 peaks 在基因特征的分布情况；
• 然后进行可视化：
  • 用 plotHeatmap 绘制热图；
  • 用 plotProfile 绘制折线图。

2.1 ComputeMatrix 计算

计算 TSS 位点前后 10K 的 peaks 分布情况：

computeMatrix reference-point -p 15 --referencePoint TSS -b 10000 -a 10000 -R ucsc_refseq.bed6 -S test.bw --skipZeros  -out ./test.TSS.gz  --outFileSortedRegions ./test.genes.bed# reference-point # 选择模式
# -p 15 线程
# --referencePoint TSS  # 选择参考点: TES, center
# -b 10000 -a 10000  # 感兴趣的区域，-b上游，-a下游
# -R  基因注释信息
# -S  提供的 bigwig 文件
# --skipZeros
# -out ./test.TSS.gz  输出为文件用于plotHeatmap, plotProfile
#--outFileSortedRegions  ./test.TSS.bed  输出的文件名

问题：如何获取 TSS bed 文件？

下载地址：UCSC-refFlat.txt.gz

转化为 bed 格式：

zcat refFlat.txt.gz | awk '{print $3"t"$5"t"$5"t"$2"t"$1"t"$4}' > ucsc_refseq.bed6 

发现报错：RuntimeError: None of the input BED/GTF files had valid regions

当把TSS 的 BED文件中 end + 1 就没有报错了。

zcat refFlat.txt.gz | awk '{print $3"t"$5"t"$5+1"t"$2"t"$1"t"$4}' > ucsc_refseq.bed6 

2.2 plotHeatmap 绘制热图

可以单独对一个样本画图：

$ plotHeatmap -m matrix.gz -out ExampleHeatmap2.png 

也可以把多个图放在一起，同时设置 --kmeans 聚类的数量， --colorList 修改颜色和 --whatToShow 修改显示的图形。

$ plotHeatmap -m matrix_two_groups.gz -out ExampleHeatmap2.png --colorMap RdBu --whatToShow 'heatmap and colorbar' --zMin -3 --zMax 3 --kmeans 4

参考：Deeptools-plotHeatmap

2.3 plotProfile 绘制折线图

$ plotProfile -m matrix.mat.gz -out ExampleProfile1.png --numPlotsPerRow 2 --plotTitle "Test data profile"

可以看到和 plotHeatmap 的用法基本一致。

2.3.1plotProfile 可以改变线的颜色，或者选择不根据样本而是通过分组来画图。

下面是使用相同的数据集，但是设置了一系列不同的参数。

$ plotProfile -m matrix.mat.gz -out ExampleProfile2.png --plotType=fill  # add color between the x axis and the lines--perGroup  # make one image per BED file instead of per bigWig file--colors red yellow blue --plotTitle "Test data profile" # 图片标题

2.3.2 使用参数 -- kmeans 设置聚集的数目，这里设置两组：

$ plotProfile -m matrix.mat.gz --perGroup --kmeans 2 -out ExampleProfile3.png

注意 -- kmeans 只适用于没有分组的数据，不然只有第一组会聚集。

2.3.3 使用 –plotType heatmap 参数绘制热图

$ plotProfile -m matrix.mat.gz --perGroup --kmeans 2 -plotType heatmap -out ExampleProfile3.png

PS：想学通一个软件，果然还是得看原始的 manual 啊。虽然网上有很多资料，但不一定全面，也不一定满足自己的需求。

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梨酱：[文献阅读03] 生命起源时期RNA嘧啶和DNA嘌呤核苷的选择性形成​zhuanlan.zhihu.com

梨酱：[R 01] 不要一直用ggplot2啦，尝试用ggpubr画图吧！​zhuanlan.zhihu.com

梨酱：[Python 2] Python-docx包的使用，快速处理 Word 文件！​zhuanlan.zhihu.com

参考：

1. 深海工具-DeepTools. 徐春辉. 生信媛
2. 自己动手计算TSS Enrichment score. lzyg 生信修炼手册
3. Deeptools manual
4. BAM神器--Deeptools使用指南. 徐洲更生信媛
5. https://github.com/deeptools/deepTools/issues/712