Cell：首次揭示肿瘤胞内菌在癌症转移过程中的作用

全球乳腺癌新发病例高达226万例，已成为第一大癌。起初人们认为肿瘤细胞内部是无菌的，也有研究表明在免疫缺陷小鼠肿瘤细胞内会存在一些微生物群。2022年4月，西湖大学蔡尚教授团队在cell上发表一篇名为“Tumor-resident intracellular microbiota promotes metastatic colonization in breast cancer”的文章，该研究借助多种实验方法证明肿瘤细胞内部存在细菌，并证实了这类细菌在肿瘤发生中的重要作用。

一．研究亮点

1. 排除宿主污染和环境噪音，确定肿瘤中的常驻菌位于细胞内

2. 探索肿瘤胞内菌在肿瘤进程中的作用

二．实验设计

三．主要结果

1. 乳腺癌肿瘤细胞存在活的常驻菌

设置4个分组：负对照（NTC）、环境对照（EBC）、正常乳腺细胞、乳腺癌细胞。qPCR检测各个样本中细菌的丰度，发现乳腺癌细胞的常驻菌的丰度显著增多，正常乳腺细胞也含有一些常驻菌。随着肿瘤体积的增大，细菌密度相对保持不变，且这些菌可以通过平板培养，证明这些常驻菌是活菌。

图1 qPCR实验以及平板实验

2. 不同分组中常驻菌多样性分析

多样性测序分析常驻菌的组成以及多样性。PCoA分析显示肿瘤和正常组织中的常驻菌不同，shannon指数显示肿瘤细胞常驻菌多样性显著低于正常细胞，说明肿瘤对细菌具有选择性，肿瘤细胞常驻菌中的兼性厌氧型细菌显著高于正常细胞。

图2 常驻微生物多样性分析

3. 有些常驻菌位于细胞内

借助16S荧光原位杂交(FISH)分析、脂多糖(LPS)染色和脂磷壁酸(LTA)染色技术以及高分辨率电子显微镜，发现这些菌存在于胞内，该结果通过抗生素验证。

图3 部分常驻菌位于胞内

4. 肿瘤细胞内微生物的作用

探究肿瘤细胞内微生物的作用，需要排除肠道菌群、胞外菌对实验的干扰，ATBx（多种抗生素混合物）通过灌水进入小鼠体内，可以杀死肠道微生物和胞内细菌；ATBx通过组织注射可以只杀死肿瘤内细菌；多四环素通过灌水进入小鼠体内，可以杀死胞内细菌。

图4 三种处理小鼠的方式

分析不同分组（control、ATBx-DW、ATBx-IV、DOx-DW）中小鼠肿瘤细胞的生长、转移情况，发现仅杀死肿瘤内部的细菌并不会影响肿瘤的生长，但会影响肿瘤的转移。

通过无菌鼠探讨ATBx-DW对肠道细菌的影响，用灌水作为负对照，发现ATBx-DW不影响肿瘤的生长，但会降低肿瘤的转移。

图5 肿瘤的生长和转移情况

5. 癌细胞转移的方式

分析乳腺癌（BT）、小的转移灶（MAL）、大的转移灶（LM）、正常的乳腺（NB）和正常的肺（NL）菌的微生物多样性，发现LM菌群位于BT和正常组织之间，证明了癌细胞携带细菌从原发肿瘤转移到转移部位。通过GFP信号追踪胞内细菌，发现其转移依赖病灶的转移。

图6 探究肿瘤的转移方式

多样性的测序结果发现Staphylococcus, Lactobacillus, Enterococcus, 和Streptococcus,这些胞内菌在NB、BT、MAL、LM的丰度中都很高，且都可以进行体外培养。

图7 显示肿瘤进展过程中各种菌株的动态分布的热图

6. 肿瘤胞内菌群可以促进病灶的转移

显微镜观察到不同胞内菌侵入细胞的能力不同，其中粪肠球菌（E. faecalis）的侵入能力最弱，同样携带粪肠球菌的肿瘤细胞定植能力最弱，推测肿瘤细胞的定植能力与携带的胞内菌的侵入能力有关。

图8 胞内菌在病灶转移局部过程（从血管到肺）中的作用

研究团队把这几种胞内菌分别注射到多四环素处理过的肿瘤细胞内无菌的小鼠体内，培养30天后，观察小鼠体内肿瘤情况，发现对原位肿瘤的影响并不大，但可以恢复肿瘤的转移能力。在没有转移能力的肿瘤中（wnt模型）可以得到同样的结果。

图9 胞内菌在肿瘤转移过程中的作用

7. 胞内菌能增强肿瘤细胞在机械胁迫下的生存能力

KEGG通路分析发现流体剪切应力通路，该通路在粪肠球菌（侵入能力最弱的胞内菌）注射的小鼠中不表达，在其他胞内菌注射的小鼠中表达。体外流体压力试验证了一些胞内菌可以通过提高肿瘤细胞的抗机械压力进而提高肿瘤的转移能力。

图10 胞内菌能增强肿瘤细胞在机械胁迫下的生存能力

8. 人类乳腺癌中保守的细菌群

动物实验已经证明肿瘤细胞内部存在细菌，其可以促进肿瘤细胞的转移。以人类乳腺癌细胞为研究对象，通过qPCR和多样性测序，得出了相同的结论。

图11 乳腺癌原发部位与淋巴结转移相关

四．研究结论

本研究首次证实乳腺癌组织中存在多种独特的 “胞内菌”，这些细菌在癌症转移过程中，可以帮助癌细胞抵抗血液的机械压力，提高癌症的转移能力。突破了传统的肿瘤转移理论，为深入探索肿瘤转移和治疗提供新的方向。

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