利用系统级别的光谱成像技术分析细胞器的互作组学

细胞亚器互作组学研究(一)

系统级别的光谱学观察细胞亚器互作组

在猴的成纤维细胞系中，利用共聚焦显微镜，观察猴的活细胞中的细胞亚器的数量以及体积，速度位置以及动态互作的状态。作者描述了六种不同的膜结合细胞器（内质网、Golgi、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体和脂滴）之间的两种、三种、四种和五种方式的相互作用的频率和位置，并显示这些关系随时间的变化。作者证明了每一个细胞器在三维空间中都有一个特征性的分布和分散模式，并且这六个细胞器之间有一个可重复的接触模式，这受微管和细胞营养状况的影响。作者研究的这种方法，在病理情况下，以及在药物处理的情况下，对细胞的细胞器的动态组的观察和都非常有效。

首先，作者在COS细胞中用荧光探针标记了Lyso，Mito,ER,过氧化物酶体，高尔基体，的marker基因的蛋白，并将脂滴于相应的染料进行孵育，以显示其踪迹。与此同时，作者通过带有光谱检测器的镭射扫描共聚焦显微镜进行城乡观察细胞器的互作，通过线性混合算法，作者可以观察到由不同的细胞亚器产生的荧光。作者对几种细胞亚器进行标记的蛋白Micrographs of a COS-7 cell expressing fluorescent fusion proteins LAMP1–CFP(Lyso) , Mito–EGFP(Mito) , ss-YFP–KDEL(ER), mOrange2–SKL(Perox), and mApple–SiT(Golgi), and labelled with BODIPY 665/676(Droplipid).

首先作者观察了脂滴与其他细胞器的互作。并且观察到脂滴与ER密切接触(ER作为脂质合成的场所)，且接触的时间相比于其他的细胞器更长，出来了与ER互作，脂滴也可以与其他的细胞亚器互作，这些互作暗示，脂滴可能与其他的细胞亚器之间进行脂滴的交换。
接下来作者研究了所有的细胞器之间的接触位点数目和模式。一下图分别是个细胞亚器之间的互作位点数目。虽然这些图可以显示不同细胞亚器之间的接触频率不同，但是总体情况下，这些细胞亚器在5分钟之内的互作是稳定的。而且对于此数据的统计，它们也在多个细胞中进行了，至少统计了10个细胞中这些细胞亚器的互作情况。

=在此提出疑问，影响细胞器互作的因素有哪些?当然包括营养状态以及细胞骨架的情况，那么除此之外存在那些细胞信号通路能够感知相应的变化，从而调控细胞内部细胞亚器的互作，接触和分离呢?并且，在这些过程中是否存在LncRNA的作用，如果存在的话，这些LncRNA 是如何参与这些过程的?这些问题，对于细胞亚器以及LncRNA来说，将示一个新的领域和新的征程。

在几种球型的细胞亚器中。脂滴可以与多种其他的细胞亚器互作，但是与没中细胞亚器互作的时间也不同，其中与ER互作的时间最长达到85%左右，与线粒体互作达到21%，与高尔基体的互作达到15%，与溶酶体以及过氧化物酶体的互作达到10%。

考虑到细胞骨架在细胞器分布中的重要作用，微管在组织细胞器和细胞器间接触中的主要作用11-14（扩展数据图5a），作者接下来研究了诺可达唑处使微管破裂后，观察细胞器相互作用模式的影响（扩展数据图5b）。

除了与高尔基体接触的溶酶体部分在诺可达唑处理后增加外，与其他细胞器接触的大多数细胞器部分在诺可达唑处理后互作减少，并且与计算机模型中观察到的更相似的现象。这表明微管在建立和维持多种细胞器间接触中起着至关重要的作用。我们使用基于像素的共定位分析15（扩展数据图5d，e）确认了这些结果。

除了使用诺拷哒唑之外，
研究者继续研究了细胞的营养状态对于细胞亚器之间的两两互作以及三三互作情况。
而在饥饿处理的时候，作者通过脂肪酸的过量以及脂肪酸饥饿，以及油酸过量，以及完全培养基来处理细胞，观察细胞亚器之间的互作情况，可以发现，在脂肪酸饥饿的情况下，Lipiddrop与ER以及Lyso的接触能力增强，这种增强作用可以从两个方面来说明机制，一方面LD与ER的接触增强，表明在接触的情况下，ER能够将产生的脂质更多更快的运输到LD 增加LD转脂的效率，另一方面，LD与Lyso的接触，能够使得Lyso从细胞膜获取更多的脂质，从而将这些脂质共给LD，恢复LD中的脂质的水平。

在油酸过量处理的时候，LD与Lyso以及LDD与perox的互作增强了。在完全培养基处理下LD与其他的细胞亚器三三互作的模式如下:

在上述方法的基础上，作者为了进一步的增强细胞亚器互作的空间和时间上的分辨率，开发了一种新的成像算法模式，即a lattice light sheet (LLS) implementation of multispectral imaging using an excitation-based linear unmixing approach，研究者对每个细胞中六个细胞亚器的平均数目，平均体积以及总体积进行了统计，并且发现，在细胞中，分布最广的使ER，其次使高尔基体，ER的体积约使线粒体的37倍，高尔基体使线粒体的9倍。每个细胞中的过氧化物酶体，脂滴的数目在90到190不等。

并且作者观察到，在COS7细胞中，各细胞器在X轴以及Y轴上的分布呈现出不同的模式。
作者观察到，在细胞中内质网的分布最广，而高尔基体的分布，相对来说是最窄的。

接着，作者对细胞亚器的3D成像绘制每个细胞器随时间变化的细胞质总体积，在0时，内质网仅占细胞体积的35%多一点，不包括细胞核，但在15分钟内迅速探测到超过97%，而在相同的时期，溶酶体仅占细胞体积的一小部分检测到其超过15%（图3f）。高尔基体基本上保持在核周，但可追溯到相当大的体积。

实际上，对整个细胞质体积的内质网探索可以解释它快速感知和响应细胞整体变化需求的能力。
内质网在细胞质中随着时间的变化体积而变化，这种变化，在某种程度上表明了了它在功能上的作用，感应细胞的变化需求。

接下来，研究者们对线粒体与其他的细胞亚器的互作进行了成像观察，并且也进行了ER-Mito作为一个整体，研究其他的细胞亚器与其互作的情况，发现，这二者与高尔基体的接触最多，与过氧化物酶体和脂滴的接触次之。作者猜想，这三者的互作，可能参与细胞内胆固醇的运输过程。

划重点:

细胞亚器在不同的营养状态下，互作的模式不同，ER与脂LD以及LD与Lyso的互作增强，亚器在细胞质中分布的体积不同。
在细胞骨架微管被破坏后，细胞亚器的互作发生改变，其中溶酶体和高尔基体的互作增强。
细胞亚器互作在细胞内的空间分布，存在一定的模式。
当然，万变不离其宗，在任何一种条件下，细胞器的互作，都与其在相应条件下的功能相关。