illumina平台的测序接头
Illumina作为当今二代测序市场占比份额最大的测序平台，理解其测序接头的具体结构，有助于我们了解各种建库方法。下面，我就来介绍一下illumina的接头结构以及基于此衍生出的设计模式。
- Y型接头
最常规的illumina接头就是俗称Y字形的接头，其结构如下：
备注：图片来自网络
如上图所示，红色和浅绿色的是固定序列，作用是成簇反应（桥式PCR的引物），使得文库DNA分子经过桥式PCR可以“长”到测序芯片上面，因此它的序列是固定的，也称为P5、P7序列，建好的文库使用这对引物扩增，可以起到放大文库量的作用。上述浅黄色和浅蓝色的片段，是测序引物，其作用是分别读取插入片段的两侧，可以理解为序列读取位置的指示。需要说明的是，测序引物还可以作为测定标签分子序列的测序引物使用。深蓝色和深绿色的，分别标注有8nt P7 index和8nt P5 index的区段，就是我们常说的标签分子序列，用于识别不同文库的序列的。
实际上，我们合成的引物都是单链的，illumina推出的接头是双链的。两条单链引物直接仅有几十碱基是互补配对的，其余碱基不会形成互补配对关系。因此，退火好的接头，需要低温保存，且尽量避免反复冻融。 - PCR方法建库的接头结构
如上图所示的，是扩增获得illumina文库的设计结构。第一轮PCR反应，特异性上下游引物分别携带部分Read1测序引物、Read2测序引物，PCR反应完成之后，即可获得带有部分接头的扩增产物，以此为模板，设计二轮扩增引物，引物与第一轮的Read1测序引物、Read2测序引物部分互补，进行二次扩增，以补齐完整的P5、P7引物，从而获得完整的P5、P7结构。那么就可以在illumina测序仪上进行测序了。需要说明的是，这样的结果也可以简化为一步法，那就是直接合成携带完整P5、P7引物的“特异性”引物，那么PCR反应完成后，经过必要的纯化，即可获得测序文库。该方法的问题在于会提高合成成本，且需要稍微摸索一下扩增反应体系。
- 小Y字形接头
如上图所示，将illumina原来的大Y字形改短之后，变成小Y字形，通过增加P5、P7端引物长度，从而获得完整illumina文库。别看就这小小的改动，却对大规模建库及避免重复起到了极其重要的作用。本质上说，这种设计结构是将index序列下放到二次扩增的引物上了。这样做的好处是：a）进行DNA连接的时候，不需要对应很多事先准备好的长接头，而是全部采用同一管来源的短接头，操作速度会加快，且不担心交叉污染；b）如果有2组人同时建库的时候，一旦发现index重叠现象，只要还保留有原始的DNA连接产物，即可快速重新组合index，重新扩增，获得新的文库。由于二次扩增循环数普遍是8-12个左右，因此时间上来讲，半个小时到45分钟即可解决问题，不会耽搁某一组的实验进程。c）index引物不需要退火，合成单链就行，降低合成成本。
5. UMI接头
备注：图片来自IDT公司
随着illumina推出NovaSeq6000机器以来，极大提高了测序通量。这同时带来了一个新的问题，就是测序的过程中，容易发生index读取错误，尤其是index引物没有纯化干净的时候更为明显。另外，随着对极低频突变检测的需求，需要确保PCR扩增中引入的错误被排除，因此IDT公司开发出了UDI和UMI甚至合二为一的接头。其结构如上图所示。与之前的接头的区别主要是2点：第一，P5、P7两端的index均是唯一，不再交叉组合，可以最大限度避免污染，从而导致数据搞错的现象；第二，P7端index后面还接了一段UMI分子，其实就是一段随机合成的“N”碱基，长度最高是16个碱基。不过，由于测序供应商不倾向于测这类模式，因此这段UMI可以设计在P7端的插入片段位置，那样对于合成短接头的要求就极高，这就是另外一个课题了。
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