2020.10.08丨全长转录组之参考基因组比对

比对软件介绍
- 目的：定位Iso-Seq分析得到的全长转录本在基因组中的位置，从而得到转录本结构和可变剪切等信息。
- 推荐比对软件：GMAP，minimap2，deSALT
  参考网址：https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake/wiki/Best-practice-for-aligning-Iso-Seq-toreference-genome:-minimap2,-deSALT,-GMAP,-STAR,-BLAT
  - GMAP
    - GMAP（a Genomic Mapping and Alignment Program），是一款针对mRNA和EST序列的基因组定位和比对程序。该软件2005年在Bioinformatics 杂志正式发表，一直持续更新升级，目前最新版是Version 2020-06-30。PacBio测序技术出现后，GMAP常用于Iso-Seq全长转录本的比对，在该应用中引用量最高。
    - 2005年发表文献：GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences.https://academic.oup.com/bioinformatics/article/21/9/1859/409207
    - 2016年发表文献：GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-3578-9_15
    - 下载：wget http://research-pub.gene.com/gmap/src/gmap-gsnap-2020-06-30.tar.gz
    - 安装：tar -zxvf gmap-gsnap-2020-06-30.tar.gzcd gmap-2020-06-30./configure --prefix=$PWDmake && make install
    - 测试：（显示帮助信息）./gmap-2020-06-30/bin/gmap
    - 使用：
      - 创建索引
        
        gmap_build -D path -d dbname -k kmer EndFragment
        
        参数说明：-D 创建索引的存放路径（默认存放在安装路径下的share文件夹）；-d 创建索引的名字；-k 创建索引的kmer值，默认值为15。
      - 序列比对
        
        gmap -D ./gmapdb -d hg38 -n 0 -t 8 -z sense_force -f samse flnc.fasta >flnc.fasta.sam 2> flnc.fasta.sam.log
        
        参数说明：-D 创建索引的存放路径（默认存放在安装路径下的share文件夹）；-d 创建索引的名字；-n 设置0，表示同时输出linear alignment和chimeric alignment；-t 线程数；-z 设置cDNA方向；-f 指定输出文件的格式；samse = SAM format (without setting paired_read bit)
  - Minimap2
    - Minimap2是李恒18年用C语言开发的一种通用序列比对程序，可将DNA或mRNA序列与大型参考数据库进行比对。典型的应用包括：1）PacBio或ONT基因组reads比对；2）发现长reads之间的重叠；3）针对PacBio Iso-Seq或Nanopore cDNA的剪切比对；4）用于二代单端和双端数据比对。该软件2018年在Bioinformatics 杂志正式发表。（2019年IF=5.6）
      参考文献网址：https://academic.oup.com/bioinformatics/article/34/18/3094/4994778
    - 下载：wget https://github.com/lh3/minimap2/releases/download/v2.17/minimap2-2.17_x64-linux.tar.bz2安装：tar -jxvf minimap2-2.17_x64-linux.tar.bz2（注：解压后得到预编译二进制文件，可直接使用，无需安装）测试：（显示帮助信息）./minimap2-2.17_x64-linux/minimap2
    - 使用
      - step1：创建索引（可选）minimap2 -d hg38.mmi hg38.fa##
      - step2：序列比对minimap2 -t 10 -ax splice -uf --MD --secondary=no -C5 -O6,24 -B4 hg38.mmi flnc.fasta >flnc.fasta.sam 2> flnc.fasta.sam.log
        
        参数说明：-t 线程数；-ax 不同的数据类型指定不同的模式；Iso-Seq数据选择splice；-uf 对于Iso-Seq数据，只考虑转录链；--MD 输出MD标签；--secondary=no 输出最好的比对结果；-C5 识别非典型的GT-AG剪切位点，灵敏度更高；-O6,24 -B4 可以找到更多外显子；输出格式可支持sam和paf格式。
  - deSALT
    - deSALT(de Bruijn graph-based Spliced Aligner for Long Transcriptome reads) ，是哈尔滨工业大学王亚东团队开发的一款专门针对于转录组长reads的剪切比对软件。原理：采用两遍比对方法，构造基于德布莱英图（De Bruijn graph）的比对骨架以推断外显子，并使用它们来生成剪接的参考序列以产生精确的比对，更好的解决小外显子、测序错误等技术问题。该软件2019年在Genome Biology 杂志正式发表。（2019年IF=12.1）
      参考文献网址：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-019-1895-9
    - 下载：wget https://github.com/ydLiu-HIT/deSALT/archive/v1.5.5.tar.gz
    - 安装：tar -zxvf v1.5.5.tar.gzcd deSALT-1.5.5/src/deBGA-master/makecd ..make
    - 测试：（显示帮助信息）./deSALT
    - 使用：
      - step1：创建索引deSALT index hg38.fa hg38.deSALT.index
      - step2：序列比对deSALT aln hg38.deSALT.index flnc.fasta -t 12 -x ccs -O6,24 -M4 -T -o flnc.fasta.sam
        
        参数说明：-t 线程数；-x 指定reads类型，ccs\clr\ont1d\ont2d；-O6,24 -M4 对于CCS序列，可以使用此参数，减少错配和gap，提升准确度；-T 根据转录链发现剪切位点（针对Iso-Seq和Direct RNA-seq数据）。
比对软件比较
- gmap、minimap2比较
  - 比较来源于2018年minimap2发表的文章，文章认为GMAP资源消耗较大，对noisy reads比对效果不佳
- gmap、minimap2、deSALT三者比较
  - 比较来源于2019年deSALT发表的文章，文章认为deSALT的比对率更高、可以更好的解决小外显子精确比对问题
  - 三者比较参考文献
    - 网址：https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake/wiki/Best-practice-for-aligning-Iso-Seq-toreference-genome:-minimap2,-deSALT,-GMAP,-STAR,-BLAT

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