RNA-seq最新利器——全长转录组测序

1.三代测序技术PacBio SMRT Sequencing

2005年以来，转录组测序和研究的主流是基于NGS，即所谓的二代测序技术，虽然二代测序技术极大地提高了测序通量，且能够发现novel的转录本，但是由于其先天的缺陷，测序读长只能达到几百个碱基（MiSeq可以达到PE300），在转录组结构分析方面，往往效果不尽理想，譬如检测新转录本、寻找可变剪切等，由于需要用算法对转录本进行组装、重构，往往有较高的假阳性。随着三代测序平台PacBio的发展，测序读长已经能够达到平均10kb以上的读长，最大长度甚至能够大于40kb，覆盖了绝大部分典型基因的长度，因此能够很好的弥补由于读长产生的限制。

目前三代测序技术以PacBio RS II SMRT Sequencing为代表，即 Single-Molecule, Real-Time(SMRT) Sequencing，实时单分子测序，测得的序列即为一条转录本序列，无需再经过组装，且能够更加准确的检测可变剪切、新转录本、基因融合等。

以下是Pacbio平台的相关参数：

表1 Pacbio平台相关参数

2.基于PacBio的研究策略

以下为基于Pacbio测序的转录组研究流程，与常规转录组研究流程区别不大，依次为样品RNA提取、文库制备、测序和信息分析。Pacbio对RNA的起始量要求较高（7ug），建议至少准备3个以上的文库，以覆盖不同长度范围的转录本，且目前建库方式只能是提取PolyA的方式建库。信息分析方面，除了不能定量之外，基本可以进行二代测序的所有分析。

图1 Pacbio研究流程

Pacbio ISO-seq（The PacBio isoform sequencing ）为基于Pacbio的转录组测序策略，其流程如下：

图2 Pacbio ISO-seq实验流程

测序完成后，对下机数据进行基本的处理，得到转录本（isoform）序列文件，流程如下：

图3 Pacbio数据处理

3.全长转录组研究案例

以下分享玉米全长转录组研究，该项目发表于2016年6月， Wang, B. et al. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing. Nat. Commun. 7:11708 doi: 10.1038/ncomms11708 (2016).

（1）研究策略

图4 玉米全长转录组研究流程

（2）研究结果

该项目共提取6个不同组织，每个样品的RNA加上barcode序列后，混合总RNA建库，建库长度分为6个长度范围（六个文库），每个文库测7-9个cell，以下是测序reads的长度分布，以及与参考数据库的比较。

图5 RNA提取和测序结果

表2 六个文库的测序量与长度分布

通过tofu套件对下机数据进行基本的处理后，可以得到全长转录本序列，并且由于每个组织样品有加上barcode序列，可以得到每个组织特有的Isoform。

图6 样品特有的Isoform鉴定及可变剪切检测

项目对检测的新转录本通过PLEK做了lncRNA预测，并对预测的lncRNA进行来源分类、exon个数分类、长度分类，以及组织间的overlap分析。文章中发现玉米lncRNA有如下特点：

1）鉴定的novelRNA长度整体较长（可能是得益于Pacbio研究平台）；

2）大多数lncRNA来源于基因间区；

3）大多数lncRNA为单外显子基因；

4）LncRNA表达量普遍比mRNA低。

图7 lncRNA相关分析

此外，该项目对比了Pacbio测序结果和二代测序结果得到的转录本数据，发现无论是cufflinks还是Trinity，都只能组装得到少数的全长转录本，证实三代测序能够得到更为全面的转录组序列信息。

图8 二代测序组装的转录本与三代测序结果的比较

（3）文章结论

1）通过Pacbio测序，能够发现大量的新转录本（57%），因而能够完善基因注释集，并且转录本平均长度显著高于原注释集；

2）Pacbio测序鉴定大量可变剪切，splice site与二代测序数据吻合度较好（90%），剪切位点（acceptor sites，donor sites）的甲基化能够影响剪切体的形成；

3）能够鉴定大量的lncRNA，长度超过原注释集的2倍；

4）鉴定大量的基因融合，且发现反式剪切是形成融合基因的主要原因，inter-chromosomal为主要融合来源。

5）Pacbio测序较二代测序能够得到更加完整的转录本信息。

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