文章链接：https://link.springer.com/article/10.1186/s13148-020-00973-8#availability-of-data-and-materials
DOI：https://doi.org/10.1186/s13148-020-00973-8
期刊：Clinical Epigenetics（医学2区）
发布时间：2021年2月11日
补充文件： https://doi.org/10.1186/s1314 8‑020‑00973 ‑8.

文章目录

1. 文章概述
- 1.1 背景
- 1.2方法
- 1.3结果
- 1.4结论
2. 背景详述
3. 方法
- 3.1 临床标本采集及cfDNA制备
- 3.2 5hmC库构建
- 3.3 绘制和识别5hmC富集区域
- 3.4 特征选择、模型训练和验证
- 3.5 探索5hmC标记物的功能相关性
- 3.6 TCGA - DLBC患者生存分析及基因表达相关分析
- 3.7 统计分析
- 3.8 结果
4、总结

1. 文章概述

1.1 背景

尽管R - CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)仍是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的标准化疗方案，但并不是所有患者都对该方案有反应，也没有有效的方法来预测治疗反应。

1.2方法

我们利用5hmC - Seal对86名接受R - CHOP化疗前的DLBCL患者的血浆细胞游离DNA (cfDNA)生成全基因组5hmC。为了研究5hmC改良与疗效之间的相关性，我们将患者分为训练队列(n = 56)和验证队列(n = 30)，并从训练队列中开发了一个基于5hmC的logistic回归模型，以预测验证队列中的治疗反应。

1.3结果

在这项研究中，我们确定了13个与治疗反应相关的5hmC标记物。logistic回归模型的预测性能达到0.82的敏感性(Sn)和0.75的特异性(Sp),AUC = 0.78，优于现有的临床指标。

1.4结论

研究结果表明，在R - CHOP治疗前cfDNA中的5hmC修饰与治疗反应相关，5hmC - Seal可能作为一种临床适用的、微创的方法来预测DLBCL患者的R - CHOP治疗反应。

2. 背景详述

弥漫大B细胞淋巴瘤(弥漫大B细胞淋巴瘤，DLBCL)是侵袭性淋巴组织肿瘤的主要类型，约占非霍奇金淋巴瘤的30%。虽然DLBCL患者多为老年患者，但在所有年龄的患者中均有发现。

自从十年前利妥昔单抗（R）加入环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松（CHOP）化疗方案以来，DLBCL患者的总体生存率显著提高。
然而，30-50%的患者对该标准治疗并不敏感，现有方法无法准确或有效地预测R-CHOP治疗前的治疗反应。

最近的研究表明，凋亡抑制剂survivin、活化诱导胞苷脱氨酶、血浆miRNA、外泌体miRNA和基因多态性的检测以及免疫微环境中CD3和FoxP3的存在，均为DLBCL患者治疗疗效的潜在指标。然而，这些预测因子显示出的矛盾结果尚未得到很好的解决。因此，需要一种准确有效的方法来预测R-CHOP方案的疗效。

DNA的5-甲基胞嘧啶(5mCs)是一种重要的表观遗传特征，在基因表达和肿瘤发展中起着重要作用。Kristensen等人发现DLBCL患者cfDNA中DAPK1的甲基化可以用来评估R-CHOP治疗的效果。在人类基因组中，cfDNA中的5-甲基胞嘧啶(5mc)是动态和可逆的，在活跃的dna去甲基化过程中，可通过TET酶被氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)。因此，5hmC作为DNA去甲基化(5mC)的氧化产物，也可用于评价R-CHOP治疗的效果。最近，一项研究也表明5hmC与DLBCL的预后相关。然而，其在预测R-CHOP方案对DLBCL患者治疗反应中的作用尚未确定。

在本研究中，我们使用5hmC- seal技术获取86名DLBCL患者接受R-CHOP化疗前血浆cfDNA的全基因组5hmC。我们的结果表明，R-CHOP治疗有应答者和无应答者具有不同的5hmC谱，通过生物信息学工具和机器学习算法选择的5hmC标记物可以用于预测R-CHOP治疗在DLBCL患者中的治疗反应。

3. 方法

本研究旨在通过高效的5hmC-Seal技术，发现预测R-CHOP方案疗效的5hmC标志物。
==在被招募的86例患者中，PR和CR患者被分组为对R-CHOP治疗有反应(n = 57)的和无反应(n = 29)。我们将86名患者分成训练和验证队列。本研究第一部分的目的是在这两组训练队列中筛选具有差异5hmC修饰的候选基因。该研究第二部分的目的是在验证队列中使用第一部分开发的模型预测治疗结果(图1)。

图1研究设计概述。在诊断时共收集了86个cfDNA样本，这些样本来自于R - CHOP或R - CHOP样治疗前的DLBCL患者。根据随访治疗结果，将患者分为反应组(PR & CR)和无反应组(PD & SD)。训练队列训练logistic回归模型，用于预测验证队列中的治疗反应

3.1 临床标本采集及cfDNA制备

将DLBCL患者的8毫升外周血收集到无细胞DNA收集Tubes（罗氏）中。24 h内，1350×g 4°C离心12 min, 13,500×g 4°C离心12 min，两次制备血浆。然后，将血浆样品立即保存在- 80°C。使用Quick-cfDNA血清和血浆试剂盒(ZYMO)提取血浆cfDNA，保存在−80°C。所有cfDNA样品在文库制备前均经核酸电泳验证片段大小。

3.2 5hmC库构建

所有样品均采用高效hmC-Seal技术构建5hmC库。由于化学标记法的高灵敏度，输入cfDNA可低至1-10 ng。根据下一代测序的要求，从血浆中提取的cfDNA进行末端修复，使用KAPA Hyper-Prep试剂盒（KAPA Biosystems）进行3′-腺苷酸化，然后与Illumina兼容适配器连接。在含有50 mM HEPES缓冲液(pH 8.0)、25 mM MgCl2、100 μM UDP6-N3-Glc和1 μM β-葡萄糖基转移酶(NEB)的25 μL溶液中，在37°C条件下进行糖基化反应2 h。然后，用DNA清洁浓缩试剂盒(ZYMO)纯化cfDNA。纯化后的DNA与1 μL的DBCO-PEG4-biotin (Click Chemistry T ool, 4.5 mM stock in DMSO)在37℃下孵育2小时。同样，使用DNA清洁浓缩试剂盒(ZYMO)对DNA进行纯化。同时，在1 ×缓冲液(5 mM Tris pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.2% Tween 20)中直接加入2.5 μL链霉亲和素珠(Life T technologies)，室温下反应30 min。最后，用缓冲液1-4洗涤8次，洗涤5分钟。所有的装订和洗涤步骤都是在室温下缓慢旋转完成的。然后将其重悬于RNase-free水中，进行PCR扩增，扩增周期为14-16次。根据制造商的说明，PCR产品使用AMPure XP珠(Beckman)进行纯化。库的浓度用Qubit 3.0荧光计(Life T technologies)测量。在NextSeq 500平台上进行39 bp配对高通量测序。

3.3 绘制和识别5hmC富集区域

使用FastQC(版本0.11.5)来评估序列质量。原始reads用bowtie2(版本2.2.9)[30]与人类基因组(版本hg19)对齐，并进一步用SAMtools(版本1.3.1)[31]进行过滤，(使用的参数:SAMtools view -f 2 -f 1548 -q 30和SAMtools rmdup)以保留与基因组的唯一非重复匹配。使用bedtools(版本2.19.1)[32]将对端reads进行扩展并转换为BedGraph格式，并将其归一化为对齐的reads总数，然后使用UCSC基因组浏览器中的bedGraphT oBigWig转换为bigwig格式，以便在Integrated Genomics Viewer中进行可视化。使用MACS(版本1.4.2)识别潜在的5hmcenrichregions (hMRs)，使用的参数为MACS 14 -p 1e-3 -f BAM -g hs[33]。使用床上工具合并峰值呼叫，只保留出现在10个以上且小于1000 bp的峰值区域。ENCODE称，被列入黑名单的基因组区域往往显示人为信号，也被过滤掉了。每个病人的hMRs是通过将单独的峰值呼叫文件与合并的峰值文件相交而生成的。X和Y染色体内的hMRs被排除，并作为下游分析的输入。

3.4 特征选择、模型训练和验证

== 在R-CHOP治疗前，采用两步程序选择最佳hMRs，以区分无应答组和应答组。在步骤1中，使用Python版本3.6.10的Scikit-Learn (version 0.22.1)包中的train_test_split，将DLBCL患者按分层方式随机分为训练和验证队列。在训练队列中，我们使用R(3.5.0)中的EdgeR包(版本3.24.3)识别了差异修改的5hmC区域(DhMRs)，过滤阈值(p值< 0.01和log2FoldChange > 0.5)。在步骤2中，使用Scikit-Learn中的递归特征消除算法(RFECV)进一步过滤dhMRs(使用的参数:estimator = LogisticRegressionCV (class_weight = ’ balanced '， cv = 2, max_iter = 1000)， scoring = ’ accuracy ')。然后，我们用从步骤2(参数:maxiter = 100，方法=“lbfgs”)中选择的特征训练logistic回归CV模型(LR)。训练后的LR模型用于预测验证队列患者的治疗结果。采用受试者工作特征(ROC)分析评价模型性能。==

3.5 探索5hmC标记物的功能相关性

我们在第1步中使用ChIPseeker软件包(版本1.20.0)[36]对dhMRs进行了注释，并将最接近标记区域的基因用于以下功能分析。GO富集分析(生物过程)是由ClueGO(版本2.5.5)和CluePedia(版本1.5.5)插件完成的，来自Cytoscape软件(版本3.7.2)(参数使用:中等网络特异性，Bonferroni逐级pV校正和双侧超几何检验)。我们使用搜索T工具检索相互作用基因(STRING)数据库(version 10.0, https://strin g-db.org)来寻找5hmC标记物的蛋白质-蛋白质相互作用。然后，利用Cytoscape软件构建PPI网络。

3.6 TCGA - DLBC患者生存分析及基因表达相关分析

生存分析方面，我们使用GDC -client (version 1.5.0)从GDC data Portal的TCGA-DLBC数据集中下载48例DLBLC患者的mRNA HTseqFPKM数据，并下载人工管理的临床数据，包括总生存期(OS)、疾病特异性生存期(DSS)、无病间隔期(DFI)、和无进展间隔(PFI)从UCSC Xena。R中Survminer包(版本0.4.6)和survivva包(版本2.44-1.1)用于生存分析。
根据最大选择秩统计算法（maxstat）确定的临界点，48例患者被分为高表达组和低表达组
通过Kaplan-Meier曲线和logrank检验评估每个基因的生存分析。对于生存分析，p值< 0.05认为有统计学意义。在基因表达相关性分析方面，使用了一个名为TIMER2.0的web工具，该工具整合了所有TCGA表达数据，探索TCGADLBC数据集中5hmC标记物与其他感兴趣基因的mRNA表达关系。采用Spearman秩相关法进行相关分析。

3.7 统计分析

对于临床数据，连续变量以平均值(SD)表示，分类变量以计数(百分比)表示。为了解分类/连续变量与治疗结果之间的关系，分别采用Kruskal-Wallis秩次检验和χ2检验。双侧p值< 0.05认为有统计学意义。用R-base中的glm函数和R-base中的pROC包(version 1.15.3)估计临床数据的预测能力。

3.8 结果

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的临床特点
所有86例患者的临床总结，包括基线特征和实验室数据如表1所示。

86例DLBCL患者中，男性46例，女性40例。所有患者的中位年龄为54.6岁，63.9%的患者为晚期疾病(包括III期和IV期)。重要的是，所有患者均为新诊断的DLBCL，并接受了标准的R-CHOP化疗。治疗4个周期后对所有患者进行疗效评价。根据Lugano 2014标准的疗效标准，患者的治疗反应为:CR 32例(37.2%)，PR 25例(29.1%)，SD 14例(16.3%)，PD 15例(17.4%)。另外，根据Hans模型，生发中心B细胞(GCB) 23例(26.7%)，非GCB 61例(70.9%)，未知细胞来源2例(2.3%)。国际预后指数(IPI)评分结果显示，52.3%的患者(IPI评分> 2)属于高中危/高危组。WBC、LDH、β2MG均值分别为6.94 × 10-4 /L、364.33 U/L、2.84 mg/L。

培训队列中对R - CHOP治疗有反应者和无反应者的5hmC特征不同
86名DLBCL患者被随机分为训练队列(n = 56)和验证队列(n = 30)(图1)。我们使用hmC-Seal生成训练组患者的全基因组5hmC谱，包括对R-CHOP治疗有反应的35例和无反应的21例。在有应答者和无应答者中，总体的5hmC富集(所有hMRs)在内含子、基因间和启动子区域最为常见，尽管在任何基因组特征类型中，这两组之间都没有发现统计学上的显著差异(图2a)。同时，我们进行微分分析(EdgeR;p < 0.01, fold change > 0.5)，观察到205个DhMRs，包括有应答者与无应答者相比上调(n = 124)和下调(n = 81)区域(图2b)。
例如，FBXL4（图2c）对应答者的羟甲基化高度富集（p=0.00087），而CTDP1（图2d）对非应答者的羟甲基化高度富集（p=0.00033）。
此外，前205个DhMRs在内含子区、基因间区和启动子区富集最显著，与前人研究一致45,46。最后，使用默认聚类方法的热图结果表明，这205个DhMRs可以有效地将应答者与非应答者区分开来(图2f)。

图2训练队列(n = 56) DLBCL患者血浆cfDNA中5hmC分布特征。按R - CHOP治疗反应分组的不同基因组特征的全基因组5hmC分布(PDSD vs PRCR)。b火山阴谋。显著改变的基因(abs (log2 Foldchange)≥0.5;p值< 0.01)用红色(上)或绿色(下)突出显示，使用应答者组(PRCR)作为参考(n = 205)。黑点表示没有差异表达的基因。c, d按治疗反应分组的FBXL4和CTDP1的boxplot (PDSD vs PRCR)。绘制TMM归一化5hmC富集值的Log2变换，采用Wilcoxon t检验。e不同基因组特征中205个DhMRs的平均log2折叠变化值(橙色表示124个5hmC -上DhMRs，蓝色表示81个5hmC -下DhMRs，红色表示所有205个DhMRs)。f 205个DhMRs标记物的热图，标记了治疗反应、批次和性别信息。跨基因和样本进行无监督层次聚类

路径分析和功能探索
对DLBCL患者205个5hmC标记物(附加文件1:表1)的通路分析表明，某些典型通路中存在功能富集。最丰富的GO生物途径包括α-βT细胞分化、蛋白质赖氨酸N-甲基转移酶活性和组蛋白H3-K9修饰等信号传导（图3a）。在这些途径中，已知α-βT细胞分化的信号与肿瘤生长和凋亡有关，这表明DhMRs可能参与免疫系统[47–49]。同时,去中心的功能交互网络(图3 b)表明这些基因,包括BCL2凋亡调节器(BCL2),公关/设置域1 (PRDM1)、前列腺素E受体4 (PTGER4) SMAD家庭成员7 (SMAD7), h2像同源框(HLX),奉献者的胞质分裂2 (DOCK2)和SH3域包含无名指1 (SH3RF1),参与了调节T细胞激活和分化的通路。

图3使用Cytoscape软件对205个5hmC标记物进行GO富集分析和功能探索。氧化石墨烯富集条状图(*p = 0.005 - 0.05， **p = 0.0005-0.005)。b氧化石墨烯富集和基因概念网络。节点大小与从网络中计算出的p值成正比

5hmC标志物对R - CHOP治疗反应的预测效果优于临床指标
同样，我们为验证组中的患者生成了全基因组5hmC，包括对R-CHOP治疗有反应的22例和无反应的8例。通过使用基于logistic回归CV估计的递归特征消除算法，我们进一步将5hmC标记从205个减少到13个，实现了最好的交叉验证得分(附加文件2:图S1)。此外，我们发现LR模型选择的13个5hmC标记物(表2)可以在训练组和验证组中区分有应答者和无应答者(图4a, b)。

图4所示。培训和验证队列中5hmC标志物对治疗反应的预测。a, b 13个5hmC标记物的热图，在训练和验证队列中标记了治疗反应、批次和性别信息。跨基因和样本进行无监督层次聚类。c在训练和验证队列中有13个5hmC标记物的分类模型的受试者工作特征(ROC)曲线。真阳性率(敏感性)绘制在假阳性率(1特异性)的函数中。d混淆矩阵，显示模型在验证队列中的表现(有应答者:22，无应答者:8)。e DLBCL患者LDH、分期及LDH结合分期分型模型的ROC曲线

同时，这13个5hmC标记物可以有效预测训练组(AUC = 1.00)和验证队列(AUC = 0.78)中对R-CHOP治疗有应答者和无应答者(图4c)，在验证队列中达到0.82的敏感性和0.75的特异性(图4d)。最后，我们还计算了13个5hmC标记在训练和验证队列中的每个个体的AUC(附加文件2:图S2A, B)。其中，ARHGEF12和ZNF280D显示了最好的预测性能，在验证队列中的AUC为0.76。
我们还研究了现有的临床指标，包括分期、病理、IPI、LDH、β2MG和WBC，以及R-CHOP治疗反应之间的关系。在所有的临床指标中，只有LDH(连续变量，p = 0.03474)和分期(分类变量，p = 0.004453)与治疗反应有显著的相关性(附加文件2:表3)。因此，我们用这两个指标建立logistic回归模型来预测治疗反应。如所料，LDH水平、分期及LDH联合分期(LDH +分期)也可预测一定水平的治疗反应。而LDH水平(AUC = 0.646)、分期(AUC = 0.658)和LDH联合分期(AUC = 0.669)的AUC低于5hmC标记(AUC = 0.78)(图4e)。

在DLBCL患者中，5hmC标志物与R - CHOP治疗反应之间的潜在关联
为了进一步了解这13个5hmc修饰的标记基因与R-CHOP治疗反应之间的潜在关联，我们研究了它们的mRNA表达曲线，并将其与来自TCGA-DLBC数据集的48名DLBCL患者的b淋巴细胞抗原CD20 (MS4A1)(利妥昔单抗靶基因)的mRNA表达曲线进行了比较。在这13个标记基因中，我们发现MS4A1的mRNA表达与ARHGEF12 (rho = 0.385)、FBXL4 (rho = 0.376)、GOLGB1 (rho = 0.434)、LMBR1 (rho = 0.45)的mRNA表达呈正相关(附加文件2图S3A-D)。
我们决定进一步研究Rho的潜在机制
鸟嘌呤核苷酸交换因子12（ARHGEF12）的mRNA表达与MS4A1呈正相关，在13个5hmC修饰的标记基因中，其AUC在验证队列中达到最高。
根据最近的研究，启动子区域的5hmC富集与基因表达水平呈正相关[25,50]。在我们的研究中，ARHGEF12在无应答者中羟甲基化高度富集(p = 0.022)(图5a)，并且羟甲基化位点位于启动子区域(附加文件3:因此，我们推测ARHGEF12启动子区5hmC富集的变化可能导致该基因mRNA表达的变化。
此外，从STRING数据库构建的PPI网络中，我们确定了几个与ARHGEF12相关的基因，包括Ras Homolog Family Member A (RHOA)、Ras Homolog Family Member B (RHOB)、Ras Homolog Family Member C (RHOC)、Cell Division Cycle 42 (CDC42)、Rho Associated coil - coil Containing Protein Kinase 1 (ROCK1)、G蛋白α亚基12 (GNA12)和G蛋白α亚基13 (GNA13)(图5b)。有趣的是，我们发现这些基因的表达(RHOA (rho = 0.667)、RHOB (rho = 0.604)、CDC42 (rho = 0.676)、ROCK1 (rho = 0.832)、GNA12 (rho = 0.721)、GNA13 (rho = 0.784)均与ARHGEF12高度正相关(图5 - h)。此外，从TCGADLBC数据集的生存分析结果中，我们发现，ARHGEF12和CDC42高表达的患者的总生存时间(OS, days)显著低于这两个基因低表达的患者(图5i, j)。我们发现ARHGEF12的mRNA表达与几个免疫相关基因如CD44、CD47、CD53、CD59和CD274呈正相关(附加文件2:图S4A-E)。最后，我们对所有与ARHGEF12相关的基因(图5k)进行了GO富集分析(图5k)，发现GO主要富集在Rho信号通路中，这与从STRING数据库构建的PPI网络一致。

4、总结

在本研究中，我们的目标是利用hmC-Seal测序法，基于R-CHOP治疗前血浆cfDNA的5hmC谱，建立一个模型来预测R-CHOP方案对DLBCL患者的治疗反应。
在我们的队列中，我们发现R-CHOP方案有应答者和无应答者在5hmC富集上有显著差异，通过差异分析方法检测到205个DhMRs。此外，对205个有应答者和无应答者之间5hmC差异修饰的标记基因的通路分析表明，α - β T细胞激活和分化信号通路富集。众所周知，肿瘤的进展和耐药与肿瘤微环境(TME)的生理状态高度相关，因此，肿瘤微环境(TME)是一个有吸引力的治疗靶点，与肿瘤治疗的疗效密切相关。肿瘤微环境的组成复杂，主要包括肿瘤细胞、基质元素、细胞外基质、炎症和免疫细胞，它们与肿瘤的发生、转移和肿瘤治疗密切相关。重要的是，cfDNA不仅来源于肿瘤细胞，还来源于肿瘤微环境。因此，这些5hmC标记基因可能与R-CHOP治疗的效果有关。
此外，我们发现机器学习算法过滤的13个5hmC标记可以很好地区分训练和验证队列中的无应答者和应答者。
同时，13个5hmC标志物建立的logistic回归模型预测效果优于现有临床指标如LDH (AUC = 0.646)、分期(AUC = 0.658)，其敏感性为0.82，特异性为0.75 (AUC = 0.78)。此外，结合LDH和分期，AUC也低于13个5hmC标记物。
综上所述，这些发现表明，来源于cfDNA的5hmC标记物可以作为一种有效的生物标记物，用于对DLBCL患者使用R-CHOP方案的治疗反应进行最低限度的无创预测。
最近的研究表明，在启动子区域富集5hmC可以促进基因转录=。在我们的研究中，在无应答者中，ARHGEF12的羟甲基化在启动子区富集。值得注意的是，在13个5hmC标记基因中，ARHGEF12的预测性能最好，其mRNA表达与TCGA-DLBC数据集中的MS4A1 mRNA表达呈正相关。
同时，ARHGEF12的表达与RHOA、RHOB、CDC42、ROCK1、GNA12、GNA13等rho相关基因呈高度正相关。既往研究表明Rho信号通路与肿瘤微环境、肿瘤起始、增殖和转移有关，并可能包含新的生物学意义和治疗机会。这些与ARHGEF12相关的基因都在Rho信号通路中发挥着重要作用，其在肿瘤起始、增殖、转移和耐药中的作用得到了既往研究的良好支持。此外，各种研究也报道了ARHGEF12的潜在功能。例如，ARHGEF12是g蛋白偶联受体(GPCRs)下游Rho信号的激活剂，在趋化因子驱动的肿瘤细胞侵袭中发挥重要作用。更重要的是，ARHGEF12的表达也与免疫相关基因如CD44、CD47、CD53、CD59和CD274呈正相关。因此，我们怀疑ARHGEF12与其相关基因一样，在Rho信号通路中起关键作用，可能与弥漫性大B细胞淋巴瘤的起始、增殖、转移和治疗有关，但这些关系的深层生物学基础有待进一步研究。综上所述，前期研究提供的证据提示，ARHGEF12可能是与R-CHOP治疗反应相关的潜在药物靶点。
然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，样本量相对较小，可能不能完全代表所有DLBCL患者。我们的模型的性能还需要在更大的研究队列中进行测试。其次，本研究仅针对中国患者，可能不代表其他种族的DLBCL患者。第三，5hmC在ARHGEF12中的调控机制及其与R-CHOP治疗效果的相关性尚不清楚。因此，需要进一步研究。未来，我们的目标是增加DLBCL患者的样本量，并找到更稳定可靠的5hmC标记基因来预测R-CHOP方案的治疗效果。
总之，我们的结果表明，从血浆cfDNA中提取的5hmC标志物可以用来预测R-CHOP方案治疗的DLBCL患者的治疗反应。同时，5hmC-Seal可能作为一种微创非侵入性技术，揭示与R-CHOP在DLBCL患者治疗反应相关的潜在药物靶点。

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