利用GATK4.1 mutect2寻找体细胞突变（SNV和INDEL）

今天梳理一下最最最最（最X100）常用的mutect2体细胞变异分析流程。主要用来分析肿瘤配对样本，寻找体细胞突变比如SNV和INDEL。官网上已经有了详细的英文版教程。

软件版本：GATK4.1.1.0

官网教程：https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035894731-Somatic-short-variant-discovery-SNVs-Indels-

看下分析的流程图，然后我们从bam文件出发分步讲解：

现在假设你已经有了normal.bam和tumor.bam文件，参考文件为reference.fasta，目标区域文件为intervals.interval_list。

1. 构建normal panel

如果你有多个normal.bam做对照，在开始之前，可以利用这些normal bam构建一个normal panel作为第2步原始候选变异检测的输入参数。（这个命令行和GATK3.8相比改动比较大了）

gatk Mutect2 -R reference.fasta -I normal1.bam -max-mnp-distance 0 -O normal1.vcf.gz
gatk Mutect2 -R reference.fasta -I normal2.bam -max-mnp-distance 0 -O normal2.vcf.gz
gatk Mutect2 -R reference.fasta -I normal3.bam -max-mnp-distance 0 -O normal3.vcf.gz

gatk GenomicsDBImport \
-R reference.fasta \
-L intervals.interval_list \
--genomicsdb-workspace-path pon_db \
-V normal1.vcf.gz \
-V normal2.vcf.gz \
-V normal3.vcf.gz

gatk CreateSomaticPanelOfNormals \
-R reference.fasta \
-V gendb://pon_db \
-O pon.vcf.gz

2. 获取原始的候选变异

这一步类似于HaplotypeCaller，先根据给出的目标区域初步筛选出候选的体细胞突变。

gatk Mutect2 \
-R reference.fa \
-I tumor.bam \
-I normal.bam \
-L intervals.interval_list \
-normal normal_sample_name \
--germline-resource af-only-gnomad.vcf.gz \
--panel-of-normals pon.vcf.gz \
--f1r2-tar-gz f1r2.tar.gz \
-O somatic.vcf.gz

GATK4.1.1.0版本开始支持多个tumor和多个normal的输入（这些样本来源于同一个个体），所以你如果需要联合多个文件进行calling的话，可以写成下面这样（数据补测的福音）：

gatk Mutect2 \
-R reference.fa \
-I tumor1.bam \
-I tumor2.bam \
-I normal1.bam \
-I normal2.bam \
-L intervals.interval_list \
-normal normal1_sample_name \
-normal normal2_sample_name \
--germline-resource af-only-gnomad.vcf.gz \
--panel-of-normals pon.vcf.gz \
--f1r2-tar-gz f1r2.tar.gz
-O somatic.vcf.gz

3. 针对配对样本的交叉污染估计

这一步主要是为了获得配对样本的交叉污染估计文件calculatecontamination.table用来对原始候选体细胞突变进行筛选。

gatk Pileup \
-R reference.fasta \
-L intervals.interval_list \
-I normal.bam \
-O normal-pileups.table

gatk Pileup \
-R reference.fasta \
-L intervals.interval_list \
-I tumor.bam \
-O tumor-pileups.table

gatk CalculateContamination \
-I tumor-pileups.table \
-matched normal-pileups.table \
-O contamination.tabl

4. 测序偏好矫正及过滤

这一步主要是为了矫正测序产生的碱基偏好，对于FFPE样本来说这一步很重要。如果不是FFPE样本也可以做，并不会影响后续的结果准确度。这里用到的f1r2.tar.gz来源于第2步的输出。

gatk LearnReadOrientationModel \
-I f1r2.tar.gz \
-O read-orientation-model.tar.gz

gatk FilterMutectCalls \
-R reference.fasta \
-V somatic.vcf.gz \
--contamination-table contamination.table \
--ob-priors read-orientation-model.tar.gz \
-O filtered.vcf.gz

最后得到的filtered.vcf.gz就是过滤好的结果啦，vep注释起来，发现GATK4.1也提供了一个注释的工具Funcotator，有兴趣也可以尝试一下。

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