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桓峰基因的教程不但教您怎么使用，还会定期分析一些相关的文章，学会教程只是基础，但是如果把分析结果整合到文章里面才是目的，觉得我们这些教程还不错，并且您按照我们的教程分析出来不错的结果发了文章记得告知我们，并在文章中感谢一下我们哦！

公司英文名称：Kyoho Gene Technology (Beijing) Co.,Ltd.

这期分享一篇2022年7月发表在 Front Immunol（IF=8.786）的文章，作者研究单细胞测序揭示肝细胞癌的免疫抑制概况提供了新的研究方向。

该文章使用桓峰基因公众号里面单细胞分析教程即可实现，有需要类似思路的老师可以联系我们！单细胞测序数据分析教程整理如下：

Topic 6. 克隆进化之 Canopy

Topic 7. 克隆进化之 Cardelino

Topic 8. 克隆进化之 RobustClone

SCS【1】今天开启单细胞之旅，述说单细胞测序的前世今生

SCS【2】单细胞转录组 之 cellranger

SCS【3】单细胞转录组数据 GEO 下载及读取

SCS【4】单细胞转录组数据可视化分析 (Seurat 4.0)

SCS【5】单细胞转录组数据可视化分析 (scater)

SCS【6】单细胞转录组之细胞类型自动注释 (SingleR)

SCS【7】单细胞转录组之轨迹分析 (Monocle 3) 聚类、分类和计数细胞

SCS【8】单细胞转录组之筛选标记基因 (Monocle 3)

SCS【9】单细胞转录组之构建细胞轨迹 (Monocle 3)

SCS【10】单细胞转录组之差异表达分析 (Monocle 3)

SCS【11】单细胞ATAC-seq 可视化分析 (Cicero)

SCS【12】单细胞转录组之评估不同单细胞亚群的分化潜能 (Cytotrace)

SCS【13】单细胞转录组之识别细胞对“基因集”的响应 (AUCell)

SCS【14】单细胞调节网络推理和聚类 (SCENIC)

SCS【15】细胞交互：受体-配体及其相互作用的细胞通讯数据库 (CellPhoneDB)

SCS【16】从肿瘤单细胞RNA-Seq数据中推断拷贝数变化 (inferCNV)

摘        要

背景: 肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌病例的75-85%，是全球癌症相关死亡的第三大原因。

目的：本研究的目的是检测肝细胞癌的肿瘤免疫微环境(TIME)。

方法: 通过对单细胞和大组织测序数据的综合分析来研究HCC TIME，以揭示主要免疫细胞类型的景观。

结果: 调节性T(Treg)细胞特异性分布于肝细胞癌的时间。几个免疫检查点，包括TNFRSF4, TIGIT和CTLA4，被发现在Treg细胞中唯一过表达，糖酵解/糖异生通路在Treg细胞中富集。还发现了两个具有不同细胞毒性的nk细胞亚群的存在，一个处于激活状态，具有抗肿瘤作用，另一个处于耗尽状态。此外，我们发现HCC中的记忆B细胞存在一种独特的状态，高增殖、低分化、低活性，这是由过表达PRAP1和激活MIF-CD74轴引起的。

结论: 该文章揭示了HCC中的TIME概况，突出了主要免疫细胞类型的异质性及其在免疫抑制环境形成中的潜在机制。因此，阻断TIME的形成可能是HCC有效的治疗策略。

生信分析流程

• 相关数据准备

  数据集选择：GSE149614(7对癌和癌旁) 

• 实验技术选择：scRNA-seq

• 生信分析方法：

我们从文章的分析流程中提取所有的分析内容，整理出来就 6个分析条目，每个条目都包括分析的内容，这些分析构成了整个文章，本文属于纯生信分析的文章，下面我们就看看哪些分析可以利用桓峰基因公众号的教程来实现，点击分析条码就会跳转到对应公众号的教程，跟着教程做，您也能发轻松发高分，如下：

1. HCC单细胞数据标准化分析

采用Seurat R包 NormalizeData函数进行数据归一化。选取前14个主成分和前1500个变量基因进行后续分析。使用Seurat 'sFindClusters函数(res= 0.5)检测细胞簇，SingleR包对每个簇进行注释。使用了Monocle2和CytoTRACE (CytoTRACE (stanford.edu))在线分析揭示细胞群的分化。

2. 差异分析+GSEA+GSVA

Seurat FindMarker 函数选择差异表达基因(DEGs)，用clusterProfiler R包进行Go分析。基因集富集分析(GSEA)确定每个细胞簇的基因集富集情况。从MSigDB获取基因集和 KEGG通路。然后在细胞簇间对50个标志性基因集进行基因集变异分析(GSVA)。此外使用AUCell R包来估计不同细胞组的定制基因集评分。

3. lnferCNV分析

基于InferCNV R包来推断肿瘤细胞的拷贝数变异(CNV)。以正常组织的肝细胞作为参考集，计算肝癌细胞的CNV。

4. SCNIC分析

SCENIC R包评估基因调控网络，采用GENIC3方法外推转录因子与候选靶基因之间的共表达模块。每个模块，即每个调控子，包含一个TF及其靶基因。利用RcisTarget人类基序数据库对基因标签进行富集，并根据默认的顺式调控线索集对标签中的靶点进行修剪。使用AUCell算法评估每个细胞中每个调控子的活性。

5. 细胞通信分析

使用了CellPhoneDB研究细胞间的相互作用，通过Cytoscape对受体-配体对进行计数和可视化。

6. 肝癌细胞亚群分析

使用R中的ConsensusClusterPlus 软件包，将TCGA LlHC队列中的360例HCC样本根据其肝癌细胞进化相关基因的表达分为3个簇。绘制各簇的Kaplan-Meier(K-M)生存曲线。对3类聚类进行临床特征相关性分析。

研究结果

1. 肝癌的细胞类型分类

(A) 36个细胞簇的t-SNE图。(B)每个细胞簇中排名前五的标记基因的热图。(C)细胞在肿瘤和正常组织中的分布。(D)细胞在免疫细胞(PTPRC+)或非免疫细胞(PTPRC-)中的分布。(E)显示肝癌细胞类型的t-SNE图。这些标签由SingleR自动注释。(F)所有已识别细胞簇分布的条形图:每个细胞在肿瘤和正常样本中的比例(左)和每个患者(右)。(G)肿瘤和正常组织中表达量最高的前5个DEGs。(H)前5个deg的t-SNE图。

2. Treg细胞在HCC中富集，具有明显的代谢特征

(A) 15个T细胞亚群的T- sne图(B)四种主要T细胞亚型:CD8+ Tem、CD4+ Tem、CD8+ Tcm和Treg细胞。(C)四种t细胞亚型在肿瘤和正常样本中的分布(D)在每个患者中的分布。(E) 4个t细胞亚型的前5个标记基因。(F)免疫检查点在四种t细胞亚型中的表达热图。行Z分数表示表达式级别。T细胞的分化轨迹，根据假时间(G)和细胞类型(H)着色，如图所示。(I) GSEA显示代谢途径明显丰富(FDR <0.05)。

3. 巨噬细胞与TME的免疫抑制环境有关

(A)由CellPhoneDB构建的交互网络。圆的大小表示交互计数。更大的尺寸意味着更多与其他细胞类型的相互作用。(B) 8个亚型巨噬细胞的t-SNE图。(C)肿瘤和正常样本中8种亚型巨噬细胞的分布(D)每个患者的分布。(E) TREM2在8种亚型巨噬细胞中的表达的小提琴图。(F) TCGA LIHC队列患者的Kaplan-Meier生存曲线。log秩p值和lt;0.05被认为有统计学意义。(G)巨噬细胞免疫检查点表达的热图。行Z分数表示表达式级别。(H) gsa评分标记通路活性的差异。文中给出了用线性模型计算的t值。(I) SCENIC识别的转录因子表达的AUC评分热图。

4. 两种不同的nk细胞亚群在HCC中具有不同的细胞毒能力

(A) NK细胞11个亚群的t-SNE图。(B) 11种nk细胞亚型在肿瘤和正常样本中的分布。(C)肿瘤源性NK细胞与正常组织源性NK细胞差异表达基因(DEGs)的火山图。上调基因(log2(fold change) >1)标记为红色，而下调基因(log2(fold change)小于-1)标记为蓝色。上调和下调的基因被注释。(D) CD160、NCR3、IFNG (IFNG)和FASLG等多个激活受体在9、10和正常组织中的表达的小提琴图。(E) NK细胞的分化轨迹(右)和细胞亚群(左)。(F) SCENIC识别的转录因子表达的AUC评分热图。

5. HCC中记忆B细胞低活性状态

(A) HCC中四种b细胞亚型的t-SNE图。(B)四种B细胞亚型在肿瘤和正常样本的分布(C)在每个患者中的分布。(D)肿瘤来源的记忆B细胞和正常组织来源的记忆B细胞之间的DEGs的火山图。上调基因(log2(fold change) >1)标记为红色，而下调基因(log2(fold change)小于-1)标记为蓝色。上调和下调的基因被注释。(E和F)使用CytoTRACE测定的不同组织来源的记忆B细胞的分化状态。分数越高，分化程度越低。(G)不同组织来源的记忆B细胞在细胞周期各个阶段的细胞比例饼图。(H)肿瘤和正常样本中记忆B细胞激活记忆B细胞特征评分的条形图。根据活化的记忆b细胞相关基因CD86、AICDA、DHR59、EBI3、TBX21、KLF10、ZEB2、TFEC、ZBTB32、YBX3、CXCR3、ITGAX和SIGLEC6的表达计算特征评分。(I)肝细胞与记忆B细胞之间的受体配体对。

6. 肝癌细胞的高代谢与免疫抑制

(A)癌细胞在所有肿瘤样本中的分布。(B)肿瘤源性肝癌细胞与正常组织源性肝细胞之间的DEGs的火山图。上调基因(log2(fold change) >0.5)标记为红色，而下调基因(log2(fold change)小于0.5)标记为蓝色。(C)基因本体分析。上调和下调的deg被注释。FDR <0.05被认为显著富集。(D) gsa评分标记通路活性的差异。文中给出了用线性模型计算的t值。(E)伪时间染色的癌细胞分化轨迹。(F)基于与癌细胞进化状态相关的基因表达，通过ConsensusClusterPlus将TCGA LIHC患者聚类为3个聚类。(G) 3组患者Kaplan-Meier生存曲线。log秩p值<0.05为差异有统计学意义。(H) SCENIC识别的转录因子表达的AUC评分热图。

这篇文章利用桓峰基因公众号上的教程完全可以实现这些图表的绘制，过程需要自己细致的探究，毕竟不是很简单的分析，能发到8+也需要有一定的生信分析和结果解读的能力，有需要此类分析的老师可以联系桓峰基因！

桓峰基因，铸造成功的您！

未来桓峰基因公众号将不间断的推出单细胞系列生信分析教程，

敬请期待！！

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References:

Bai Y,Chen D,Cheng C, et al. Immunosuppressive landscape in hepatocellular carcinoma revealed by single-cell sequencing. Front Immunol. 2022;13:950536. doi:10.3389/fimmu.2022.950536