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摘要

日趋严重的抗生素抗性问题使得研究者们将目光转移到可能是新的抗生素来源的未培养细菌上。扩增子测序与短读测序分析表明宏基因组中存在多样化的生物合成基因簇（BGC）。本文通过长读长测序从南极土壤中发现千余个BGC，证明了未被研究过的谱系中的生物合成潜力。

中文标题：通过长读长宏基因组测序揭示南极土壤未培养细菌的生物合成潜力

英文标题：Biosynthetic potential of uncultured Antarctic soil bacteria revealed through long-read metagenomic sequencing

期刊：The ISME Journal

第一作者：Valentin Waschulin

通讯作者：Valentin Waschulin

作者单位：School of Life Sciences, University of Warwick, Coventry, UK

正文内容

到目前为止，宏基因组学研究表明地球上未培养的细菌具有非常高的多样性，其中包含约97.9%的细菌OTU是未被完整测序的。研究者目前可以通过对宏基因组中编码特化代谢物多样性进行描述并加以利用，对宏基因组文库的筛选也可以选出包括新的抗生素在内的化合物。对宏基因组组装基因组（Metagenome-assembled genome, MAG）中生物合成基因组（Biosynthetic gene cluster, BGC）的挖掘与分析可以获得对更多微生物天然产物的认识，为生成新的且有用的化合物提供了可能，这或许是开发新抗生素合成途径的重要一步。已有研究证明全长BGCs可以通过长读长宏基因组测序获取，另外PCR克隆可以扩增BGC的异源表达。针对BGC的鉴定、比较、与已知化合物的联系等分析都已经有相关工具被设计出来，BGC数据库也已经建立。

本研究的研究对象选取在南极洲，由于其地理与环境的特殊性，南极微生物的多样性还未被深入研究。本研究利用长读长鸟枪测序，结合基因组挖掘与基于分箱（bin）或重叠群（contig）的分类学鉴定分析了火星绿洲（Mars Oasis，位于南极南部海域）上采集的土壤中的生物合成潜力，回收了超过1,400个高度多样化且多为全长的BGCs。

图1 A) 采样点为南极“火星绿洲”；B) 长读长序列与重叠群的分类信息；C) 分箱后的bins以及鉴定为BGCs的重叠群的分类信息。

测序策略

长读长测序：牛津纳米孔测序（Oxford Nanopore）MinION（序列数约930万条，总碱基约44.4Gb，N50约9.4Kb）

短读长测序：Illumina HiSeq 150bp双端测序（序列数约1.87亿条，总碱基约28Gb）

主要结果

1.高度多样化全长BGC的回收

在本研究中，共鉴定出1417个BGCs，其中564个（39.8%）位于重叠群的头尾端，因此可能是不完整的，其他853个（60.2%）则是全长的BGCs。所有BGCs中最丰富的种类是萜类化合物（terpenes，27.2%），其次是NRPS（非核糖体多肽合成酶，15.7%）和细菌素（bacteriocins，10.1%）。

2.长读长与GTDB对于环境BGCs鉴定的提升

利用GTDB蛋白数据库替代NCBI-nr蛋白库能够将含BGC的重叠群的分类鉴定（目水平）从36.8%提升至71.8%。然而，GTDB蛋白数据库相比之下要小得多，它在较细的分类水平上的代表序列较少，因此本研究仅选用了纲水平和目水平进行了分类。

BiosyntheticSPAdes能够从短读组装重叠群中识别NRPS与PKS，利用该方法从28Gb短读数据中预测了228个NRPS/PKS BGC，其中96.7%非全长。另外，BiosyntheticSPAdes方法预测的BGCs大多数都能通过blastn比对到长读长预测的少部分BGCs上，也就是说短读测序中也有很多BGCs能够组装，只不过这种组装更碎片化。然而，由于这种碎片化，大量BGCs的完整性、边界以及潜在的修饰基因无法预测，因此其分类鉴定更难，实用性相对更低。

3.产生特化代谢物的门中的高度分化BGCs

本研究中，BGCs中有超过60%来自放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)与拟杆菌门（Bacteroidota)。属于酸杆菌门(Acidobacteriota)与疣微菌门(Verrucomicrobiota)的BGCs占总BGCs的20%。未发现古菌中的BGCs。

利用BiG-SLiCE query mode对1417个BGCs进行分析，计算其与由约120万个已知BGCs组成的预计算的GCFs（Gene Cluster Families，基因簇家族）的距离d。其中，845个BGCs距离超过900，55个离群值距离超过了1800。每个门中距离差距都很大，这表明每个门都含有与已知BGCs近源或远源的BGCs。

图2B BiG-SLiCE门水平距离，黑色虚线d=900，灰色虚线d=1800

对于某一个纲来说，其距离因不同种类的BGCs也会表现出差异。如拟杆菌门中距离值高的主要来源于NRPS类BGCs（图2C）与萜类化合物BGCs（图2E）。

图2C-H BiG-SLiCE门水平距离（按不同BGC类别）

4.放线菌门与变形菌门中未培养与未探索的纲、目显示出巨大的生物合成潜力

放线菌门中的放线菌纲（Actinobacteria）、酸微菌纲（Acidimicrobiia）与嗜热油菌纲（Thermoleophilia）包含了大量的BGCs，且这些纲中还有相当一部分BGC未被归入下一分类层级，可以认为未培养的放线菌中存在有大量的未被认知的多样性，其中含有大量BGCs。

变形菌门中未被培养的营甲烷目UBA7966被认为是一类特化的代谢物生产者。该目下鉴定出96个BGCs，其中包括有萜类化合物、细菌素、磷酸盐、NRPS类等，此外该目的覆盖度很高，说明其丰度较高；其重叠群总长度长，表明存在多个基因组。

参考文献：

Waschulin, V., Borsetto, C., James, R. et al. Biosynthetic potential of uncultured Antarctic soil bacteria revealed through long-read metagenomic sequencing. ISME J (2021). https://doi.org/10.1038/s41396-021-01052-3

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41396-021-01052-3

中国科学院生态环境研究中心

环境生物技术重点实验室

邓晔 研究员课题组发布

编译：彭玺

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