文献解读|迁徙蝗虫生理和转录水平的衰老特征

TITLE ：Aging features of the migratory locust at physiological and transcriptional levels
译名：迁徙蝗虫生理和转录水平的衰老特征
期刊：BMC Genomics
日期：2021年4月
下载链接：https://doi.org/10.1186/s12864-021-07585-3

研究介绍

迁移蝗虫（Locusta migratoria）是一种分布广泛的蝗虫。基因组信息和遗传工具的进展使得系统评估飞蝗的老化特征成为可能。在本研究中，在群居蝗虫中评估了几种生理和细胞衰老表型。获得了随着衰老的器官水平转录图谱，以分析跨物种的转录相似性和器官特异性转录特征。RNAi也验证了几个与衰老相关的基因的功能作用。

研究目的

确定迁移蝗虫（Locusta migratoria）在生理、细胞和转录水平上部分特异的衰老表型，而为进一步研究这种非果蝇昆虫的衰老提供了基础。

材料与方法

材料：北京中国科学院动物研究所同一蝗群饲养试验所用昆虫。在14∶10光/暗光照条件下，在30±2°C的群居期饲养蝗虫。日粮包括持续提供干麦麸和每天提供一次新鲜小麦幼苗。

方法：
（1）进行寿命试验。计算蝗虫的成活率，比较两组间生存曲线的Pvalue采用log-rank Mantel-Cox检验。采用GraphPad Prism进行统计分析。
（2）飞行性能的检测。记录飞行距离、飞行时长、平均飞行速度（飞行距离/飞行时间）和最大飞行速度。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估差异，然后进行多次比较的Tukey检验或采用SPSS 17.0软件进行t检验。
（3）精子数和存活能力。使用ImageJ对每个个体图像的精子计数进行量化。通过测定活精子百分比计算精子活力。
（4）RNA测序和数据处理。制备cDNA文库，Illumina平台上进行测序，并使用TopHat2将clean reads映射到蝗虫的基因组参考，采用edgeR包检测DEGs，定义为fold change > 2，调整P < 0.1。基因表达水平被测量为每千碱基每百万reads（RPKM）。RNA-seq数据保存在NCBI SRA数据库中。
（5）混杂主成分分析（AC-PCA）。调整与年龄相关同源基因的表征，AC-PCA分析采用AC-PCA软件包。
（6）Co-expression网络分析。选择在四个器官不同时间点表达不同的基因构建共表达。
（7）富集分析。对所提供的基因列表进行GO和KEGG的富集分析。利用REVIGO程序对AC-PCA分析中PC2绝对得分最高的前2000个基因的GO富集结果进行可视化分析。
（8）透射电子显微镜法。使用JEM-1400透射电子显微镜（JEOL，Tokyo，Japan）进行分析。用ImageJ对线粒体和液泡的数量进行量化。加入同一昆虫观察到的线粒体和液泡进行统计分析。
（9）脂肪体成像和共聚焦显微镜。样品使用ZEISS LSM 710共聚焦显微镜成像。
（10）TdT-介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）试验。脂肪的身体和大脑被使用原位染色细胞死亡检测设备，使用ZEISS LSM 710共焦显微镜捕捉图像。
（11）RNAi化验。使用T7 RiboMAX Express RNAi系统（Promega，P1700，美国）制备7个目标基因的双链RNA。通过定量聚合酶链反应（qPCR）研究RNAi对相对mRNA表达水平的影响。
（12）定量聚合酶链反应（qPCR）。
采用SPSS 17.0软件进行t检验，对差异进行统计学分析。对3 ~ 4个生物重复进行定量逆转录PCR。
（13）Acetyl-CoA测量。用单因素方差分析（one-way ANOVA）、Tukey检验或独立样本t进行差异评估，用SPSS 17.0进行测试。

结果

图1.成年雄性蝗虫年龄依赖性生理表型研究

A成年雄性蝗虫的生存曲线。蓝色虚线以7天为间隔划分研究周期。n = 67。B成年雄性死亡曲线的黄土曲线拟合。C、D不同年龄成年雄性的飞行表现。成年雄性7、14、21、28D的飞行距离（C）和平均飞行速度（D），差异显著用字母表示（单因素方差分析，P < 0.05）。箱线图的中心线表示中值，箱线的边界表示第75和第25个百分点。蓝线表示飞行性能随年龄的黄土曲线拟合。E、F不同年龄的成年男性精子状态。7、14、21、28岁成年男性的精子存储量（E）和精子活力（F）。显著差异以字母表示（单因素方差分析，P < 0.05）。

图2 蝗虫与典型模式物种衰老相关基因的相似性
A基因表达热图。单元格颜色代表两个样本基因表达值的Pearson相关系数。深红色表示高度正相关。右侧面板上的红色、绿色和蓝色方块表示三个时间点。B根据年龄时间点，使用混杂主成分分析（AC-PCA）调整对样本进行分类。圆点代表根据器官形状和年龄着色的样本。C Boxplot显示了GenAge数据库中有或没有确定同源基因的蝗虫基因的PC2得分。PC2评分来自AC-PCA。用Mann-Whitney U检验确定的p值。D根据AC-PCA的PC2绝对值排序的前2000个基因进行GO （Gene Ontology）富集分析。圆圈的阴影表示GO富集的相对显著性（阴影越深表示GO富集越显著），圆圈的大小对应于该功能注释的基因数量（圆圈越大表示数量越多）。

图3年龄相关差异表达基因（DEGs）的时空分布。

A不同器官与衰老相关DEGs的VENN图。括号中显示了器官特异性DEGs的总数。B条形图显示不同器官的DEG。左侧实心圆和空圆的矩阵说明了该器官在每个交叉点的“存在”（实心红色）或“缺失”（空）。右侧的条形图表示每个交叉点的DEG数。右侧显示了基因集的代表性丰富的GO和KEGG功能名称。C柱状图显示各器官中14-21 和21-28 D的DEG数量。在此期间表达增加的基因分为“向上”（红色标记）和表达减少的基因分为“向下”（蓝色标记）。顶部的数字对应于DEG的数字。

图4年龄相关转录组谱的共表达网络分析这是一个视觉网络
A由四个器官的每个网络的前5000个连接组成。边缘颜色代表不同的器官。B条形图说明了四个器官的连接和节点的数量。左侧实心圆和空圆的矩阵说明了该器官在每个交叉点的“存在”（实心红色）或“缺失”（空）。右边的条表示每个交叉点的连接和节点的百分比。由至少三个器官、两个器官共享以及单个器官独有的连接和节点的总百分比显示在右侧。C各器官中所选老化偏置模块的特征基因热图以及相应的GO和KEGG富集功能。左侧是与年龄状态相关的模块特征基因的热图。模块的名称和基因数量（显示在括号内）列在左侧。每个模块的高特征值和低特征值分别用红色和蓝色标记。右图为模块中GO和KEGG功能的富集网格，红框表示富集显著的模块（GO功能P < 0.01，KEGG功能P < 0.05）。颜色密度表示对应的p值（越深的红色表示越显著）。

图5各器官衰老相关细胞表型。
A-D衰老飞行肌肉中异常线粒体和含有残余物的液泡的代表性形态。黄色三角形表示正常线粒体，红色三角形表示异常线粒体或液泡。条长度= 1 μm。E（a-d）14、21、28D异常线粒体和含有残余物的液泡的百分比。带有量化的条形图属于同一条线上的异常。数值以均数±S.E.M.表示，差异以不同字母表示（单因素方差分析，P < 0.05）。F脂肪体细胞在14、21和28D的形态特征，蓝色，Hoechest 33，342（细胞核）；绿色，phalloidin （f -肌动蛋白）。条长度= 50 μm。（G，H） 14、21、28D时脂肪体（G）和脑（H）凋亡细胞检测。绿色，TdT-介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）（凋亡细胞）。条长度= 200 μm。

图6蝗虫衰老相关基因的功能评估。
A至少两个网络共有的枢纽基因的表达模式。左边的热图显示了该基因是否是相应网络的枢纽基因。红色和空分别表示存在和不存在。左边是基因的功能分类。右边的四张热图显示了四个器官中相应基因在衰老过程中的相对表达水平。每个基因的高表达量和低表达量分别用红色和绿色标记。B根据转录组数据，4个代表性基因在衰老过程中在4个器官的相对mRNA表达水平。C基因敲除对寿命的影响。蓝箱形图和红箱形图分别表示所选基因经dsGFP或dsRNAs处理后蝗虫的寿命。箱线图的中心线表示中值，框的边界表示第75和第25个百分点。通过Mantel-Cox检验检验的p值标注在右侧。D LIPT1敲除后飞行性能评估。标注了通过Student 's t检验评估的p值。E飞行肌肉中乙酰辅酶a的水平在老化和LIPT1敲除后。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）显示差异显著，P < 0.05（左）和Student 's t检验，*P < 0.05（右）。

结论

本研究从生理水平到转录水平对飞蝗的衰老特征进行了研究。蝗虫的衰老伴随着飞行能力和精子状态的显著损害。虽然蝗虫的衰老相关基因与典型模型物种相似，但其飞行肌肉和脂肪体的表达强烈变化以及大脑转录的微小变化等器官特异性衰老特征是蝗虫独有的。飞行肌线粒体相关基因表达变化较大，脂肪体解毒、吞噬相关基因表达变化较大。细胞评估显示，在老化的飞行肌肉和脂肪体中，线粒体和核异常增加，但在大脑中没有。此外，本文还强调了与衰老相关的4个基因（即JUN、IAP1、PGRPSA和LIPT1）在细胞凋亡、免疫和线粒体功能障碍等方面的作用，并对蝗虫的寿命、运动和代谢进行了研究。综上所述，蝗虫具有显著的衰老特征，是一种很有前景的衰老生物学研究模型，可以拓展对衰老相关代谢和应激反应变化的分子基础的理解。

END

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