【文献解读】RNAi技术在油菜基因功能研究中的应用

题目：Specific and multiple-target gene silencing reveals function diversity of BnaA2.NIP5;1 and BnaA3.NIP5;1 in Brassica napus

期刊名：Plant Cell Environ （IF=7.228）

作者：Mingliang He, Fangsen Xu

单位：华中农业大学

摘要

油菜籽 (Brassica napus) 是世界上重要的油料作物，但其生长在很大程度上依赖于硼(B)的供应。内在蛋白NIP5;1对硼缺乏下的硼吸收和植物的发育至关重要。在本研究中，系统发育和表达分析确定了两个 NIP5;1的直系同源基因BnaA2.NIP5;1和BnaA3.NIP5;1的功能。多靶点RNAi分别用于抑制BnaA3.NIP5;1或BnaA2.NIP5;1在B高效利用油菜品种QY10中的表达，以揭示BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1的作用。我们发现 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 在低 B 条件下对欧洲油菜的正常生长都很重要，而这两个基因具有不同的作用。 BnaA2.NIP5;1 主要在表皮细胞中表达，这是有效吸收硼进入根部所必需的。BnaA3.NIP5;1特异性定位于侧根细胞的远端部分以促进低硼条件下的主根伸长，这对欧洲油菜成熟期的种子生产很重要。总之，我们的多靶点RNAi策略为BnaA2.NIP5;1和BnaA3.NIP5;1之间的基因功能多样化提供了新的见解，这种方法可能适用于其他多倍体作物。

技术路线

主要结果

3.1 NIP5;1在陆地植物中的进化史

从19种不同的陆地植物中鉴定并检索了NIP5;1的氨基酸序列。NIP5;1氨基酸序列的系统发育分析，得到了与陆地植物主要谱系之间的关系的基因树（图 1a）。结果显示 NIP5;1 存在于所有主要的陆地植物中，所有 NIP5;1基因都从一个共同的祖先分化（图 1a）。我们在基础被子植物 Amborella trichopoda、双子叶葡萄和拟南芥基因组中发现了一个 NIP5;1 基因（图 1b）。在油菜和甘蓝基因组中发现了两个 NIP5;1 基因和五个 NIP5;1 基因（BnaA2.NIP5;1、BnaA3.NIP5;1、BnaA7.NIP5;1、BnaC2.NIP5;1 和 BnaC3.NIP5 ;1)。这可能是由于多倍体后发生的大量基因丢失。比较序列分析显示，BnaA2.NIP5;1、BnaA3.NIP5;1、BnaA7.NIP5;1、BnaC2.NIP5;1和BnaC3.NIP5;1基因与 AtNIP5;1 的氨基酸同一性分别为93.8%、92.4%、89.5%、92.8%和92.4%。

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3.2 BnaA2.NIP5;1和BnaA3.NIP5;1基因的表达模式

之前的研究中，通过RNA测序分析了 QY10对 B 缺乏的转录反应。我们发现 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1在QY10的根中高表达，而另外 3 个基因 BnaA7.NIP5;1、BnaC2.NIP5;1 和 BnaC3.NIP5;1 在两个根中都低表达和芽（图2a）。我们通过qRT-PCR进一步研究了QY10根中BnaNIP5;1基因的表达水平。与 RNA 测序结果一致，qRT-PCR 显示 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 在根中高表达并受B缺乏诱导，其他三个基因在高 B 和低 B 条件（图 2b）。

3.3 转基因植株的获得和基因表达量分析

采用RNAi技术抑制BnaA2.NIP5;1和BnaA3.NIP5;1的表达来研究这两个基因在QY10中的作用。将敲除载体 sRNAi BnaA3.NIP5;1 和 mRNAi BnaNIP5;1转化到QY10中以产生BnaA3.NIP5;1特异性 RNAi，以及 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 RNAi 转基因植物，分别命名为 QsRNAi 和 QmRNAi。选择三个独立的 QsRNAi 和 QmRNAi 转基因 T2 代系，通过 qRT-PCR 分析 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 在根中的表达水平。结果表明，与野生型 QY10 相比，QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物中 BnaA3.NIP5;1 的表达均显着降低（图 4a）。与野生型 QY10 相比，QmRNAi 转基因植物中 BnaA2.NIP5;1 的表达显着降低，而在 QsRNAi 转基因植物中未观察到变化（图 4b）。这些结果表明，BnaA3.NIP5;1 的表达水平在 QsRNAi 转基因植物和 BnaA2 中特异性降低。

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3.4 QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物对 B 缺乏的反应

为了研究 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 在欧洲油菜中的作用，野生型 QY10、QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物在高 B（100 μM ) 或低 B (0.25 μM) 条件下培养15天。在低B条件下，QsRNAi转基因植物表现出严重的发育缺陷，包括弯曲的叶子和粗短的根，而QmRNAi转基因植物表现出严重的缺陷，包括顶端分生组织中的多个分枝和坏死（图5b），所有这些都是典型的 B 缺乏症状。然而，它们的生长在高 B 条件下变得正常（图 5a）。在高B条件下，野生型 QY10、QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物的枝条干重、根干重和初生根长度没有差异（图 5c-e）。然而，在低 B 条件下，与野生型 QY10 相比，QsRNAi 转基因植物的枝条干重、根干重和初级根长度显着降低（图 5c-e）。此外，与 QsRNAi 转基因植物相比，QmRNAi 转基因植物的枝条和根干重显着降低（图 5c，d），而 QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物的主根长度没有差异（图 5e）。这些结果表明，BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 在低 B 条件下对欧洲油菜的生长发育很重要。

3.5 BnaA3.NIP5;1对欧洲油菜B限制条件下的种子生产至关重要

为了进一步研究 BnaA3.NIP5;1 在欧洲油菜生殖发育中的作用，我们评估了QsRNAi转基因植物和野生盆栽下QY10型。在低 B 条件下，与野生型 QY10 相比，在 QsRNAi 转基因植物中观察到更少的种子和更多的空荚（图 6b-d）。与野生型 QY10 相比，QsRNAi 转基因植物的豆荚数和每个豆荚的种子数量均显着减少（图 6f，g），导致每株种子产量下降 85% 以上（图 6e，h） .然而，QsRNAi 转基因植物和具有高 B 供应的野生型 QY10 之间的生产性能相似（图 6a，d-h）。这些结果表明，BnaA3.NIP5;1对B限制条件下欧洲油菜的种子生产至关重要。

3.6 BnaA2.NIP5;1 控制根对B的吸收

BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 主要在根组织中表达（图 2a）。我们通过RT-PCR 进一步研究了 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 表达的细胞特异性。结果显示，与阴性对照（无RT）相比，BnaA2.NIP5;1的表达主要在分裂区和伸长区的表皮细胞中检测到（图7a，b）。在欧洲油菜中，我们使用 B、10B 和 11B 的稳定同位素进行了短期标记实验。野生型QY10、QsRNAi和QmRNAi转基因植物的幼苗用25 μM 正常B预培养15 d，然后暴露于不含B的溶液中1 d，随后将植物暴露于10 μM 同位素B 1 h。结果表明，QsRNAi转基因植物和野生型QY10（图7c，d）以及10B吸收和转移（图7e，f）的10B浓度在芽和根中没有差异。与野生型 QY10 相比，QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物的枝条 11B 浓度和根部 11B 浓度均无差异。

这些结果表明在表皮细胞中表达的BnaA2.NIP5;1参与了B在根中的吸收，并有助于B在低B条件下向地上部的分布。

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