微生物文献解读：问题串联文章思路，快速看懂正文主图。

Cross-reactivity between tumor MHC class I–restricted antigens and an enterococcal bacteriophage

杂志：Science [41.845]
发表时间：21 August 2020
第一单位：Gustave Roussy Cancer Campus (GRCC), Villejuif, France
第一作者：Aurélie Fluckiger
通讯作者：Guido Kroemer, Laurence Zitvogel
链接：https://science.sciencemag.org/content/369/6506/936

点评

研究人员对肿瘤免疫治疗、肿瘤（新）抗原的热情一直不减，从肠道菌当中找交叉反应抗原也不是啥新鲜事了，但是将噬菌体和肿瘤抗原联系在一起，能够使交叉抗原、新抗原的来源更广泛且使之更易于转移，为寻找和利用这些抗原打开了一扇新大门。（Science的文章一直给人的感觉就是，不仅思路严谨，而且让人看到一个领域的无限可能。）

简介

本文发现了肠球菌Enterococcus hirae基因组上整合噬菌体的tape-measure protein存在一段多肽序列，可以作为抗原表位（epitope）和MHC-I类分子结合，产生的反应与肿瘤抗原对T细胞的反应相似（即交叉反应），从而提高免疫细胞在癌症治疗中的作用。

背景

如果不太熟悉肿瘤抗原或新抗原，可以先移步知乎：肿瘤新抗原专题一：neoantigen是啥？。也建议再自主扫盲一下肿瘤免疫治疗和免疫学基本概念等知识。

Q: 交叉反应是什么？背后理论是什么？
A: 我对交叉反应的理解是，特异性结合一类抗原A的TCR或者BCR，也能同时结合抗原B，那么A和B对于这个TCR或者BCR就有交叉反应，叫做交叉反应抗原；Molecular mimicry（分子模拟）更多地用于解释自身免疫疾病，认为某些微生物抗原与宿主自身抗原结构相似，故针对微生物抗原的特异性抗体或效应性T细胞可与相应宿主抗原产生反应，从而引起自身免疫病。在本文语境下更多的认为是微生物抗原与宿主肿瘤抗原在序列或结构上相似性、同源性高。
Q: 本文涉及的免疫机制、通路可以概括为什么？
A: 本文前期已经发表过研究结果（Daillère R et al. Enterococcus hirae and Barnesiella intestinihominis facilitate cyclophosphamide-induced therapeutic immunomodulatory effects[J]. Immunity, 2016, 45(4): 931-943.）已知涉及的免疫机制为：CTX -> 引起肠球菌转移到淋巴组织 -> 刺激CD8+ T淋巴细胞 -> 产生IFN-gamma -> 提高对肿瘤的免疫响应。（换句话说，本文涉及的免疫主要是细胞免疫，并且是CD8+ T淋巴细胞分泌干扰素杀伤癌细胞的通路）

注意：本文中涉及的抗原表位都是线性表位=多肽。

结果

特异性抗原表位TMP1（小鼠data）

Q1: 找特异性抗原序列（短肽）的流程是怎么样的？
A1:
step 1. [实验]发现只有特殊的一些strains（如 E.hirae 13144）能引起特异性的CD8+ T细胞反应。
step 2. [生信]对比有免疫原性的strains与无免疫原性的strains的细胞壁与分泌蛋白上的序列，找出可能的T细胞表位。
step 3. [生信]筛选出与H-2Kb分子有强亲和力（<50 nM）的9肽。
step 4. [实验]找出并分离出特定的9肽（结果为：TSLARFANI，又叫TMP1）。这些9肽在重新刺激（接受了CTX与E.hirae 13144治疗小鼠）的脾脏CD8+ T细胞后能够产生最多的IFN-gamma。

总体思路：找到能与CTX联用的特异性strain -> 从strain上找到特异性的抗原表位 -> 证明IFN-gamma产生的增多是由于此表位引起的 -> 证明抗肿瘤T细胞多是对此表位特异性结合的

词汇解释

Q2: CTX（Cyclophosphamide）是什么药？
A2: 环磷酰胺，是一种常见的抗肿瘤化疗药，它可以使得E.hirae从肠道转移到肠系膜和脾脏等免疫组织中去。
Q3: TMP (Tape-measure protein) 是什么蛋白？
A3: Tape-measure也叫卷尺。这个蛋白在有尾phage的尾巴上，当这个gene被缩短后，phage尾巴也同等缩短，像卷尺一样可以衡量尾巴的蛋白，因此命名为卷尺蛋白。
Q4: epitope (抗原表位) 是什么？
A4: 即抗原表面上与TCR或者BCR特异性结合的区域，一般是在线性或空间上连续的氨基酸序列，也叫抗原决定簇（CDR）。

Figure 1A-B
A: 给小鼠接种MCA205肿瘤；前三天服用广谱抗生素；day4-day19，连续喂食特定strain并间隔使用CTX药物；day25 杀死小鼠并测量tumor size。
B: 小鼠仅使用CTX或者使用CTX+不同strain在day25时，测量的tumor size。

通过B中对不同组小鼠肿瘤大小的比较，发现仅有服用CTX与E.hirae 13144 或与E.hirae IGR11，小鼠的肿瘤大小才会显著减少。其他strain对肿瘤的影响并不显著。从而找到了提高中化疗响应的特异性strain —— E.hirae 13144 和 E.hirae IGR11。

Q5: TMP1的序列在（刺激CD8+ T细胞产生IFN-gamma）通路上的特异性如何？
A5: 首先是看original和mutated的peptides对抗癌效果；其次用ELISpot看产IFN-gamma的CD8+ T细胞的数目；最后用肽四聚体技术观察TMP1特异性CTLs（毒性T淋巴细胞）/CD8+ T细胞的比例。

词汇解释

Q6:（MHC-肽）四聚体（tetramer）技术?
A6: 四聚体技术是一种可直接对抗原特异的T淋巴细胞进行标记的新方法，MHC-肽四聚体可被用于抗原特异的T细胞的表位分析。设计的四聚体结合T细胞表位如下图所示，四个MHC-肽结构被聚合在一起，并带有一个荧光标记：
Q7: ELISpot是什么？
A7: 固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT），可用于定量体外检测特异性抗体分泌细胞和CK（细胞因子）分泌细胞分泌产生的细胞因子或其他可溶性蛋白。
Q8: H-2Kb是什么？
A8: 是小鼠的MHC-I类分子的别称（H-2Kb=小鼠MHC-I）；就像HLA是人的MHC分子别称一样（HLA=人MHC）（参见http://blog.sina.com.cn/s/blog_445dac3b0101ie07.html）。

Figure 1C-E
C: 类似于Fig1A。给小鼠接种MCA205肿瘤；前三天服用广谱抗生素；day4-day10，间隔喂食并使用CTX药物（或者是CTX与特定strain的组合）；day11 取出小鼠脾脏做体外IFN-gamma回忆应答以及流式细胞的实验。
D: IFN-gamma回忆应答实验（ELISpot计数）。小鼠仅使用CTX或者使用CTX + 不同的strain，在day11取出并纯化脾脏CD8+ T细胞后，接着用被不同的肽段（无肽段、TMP1、TMP2、TMP3以及VSTNHYGLL）负载的骨髓产生的DCs（树突细胞）在体外去重新刺激T细胞，用ELISpot记录每2*10^5 T细胞产生的IFN-gamma 斑点（spot）数目。
E: 荧光肽四聚体实验（流式细胞仪计数）。用H-2Kb/TMP1（TSLARFANI）和H-2Kb/SIINFEKL（阴性对照）四聚体去结合所有CD8+ T细胞中，通过流式细胞仪计数荧光标记的细胞，从而看出现了多少百分比的TMP1特异性T细胞，以观察这些细胞的数目和分布。

从D可以看到，小鼠联用CTX+E.hirae 13144 或 CTX+E.hirae IG1后，脾脏CD8+ T细胞被TMP1负载的DC细胞重刺激，回忆应答产生的TFN-gamma比空白对照显著增多。从而说明小鼠联用CTX+E.hirae 13144 或 CTX+E.hirae IG1时，TMP1能够增强刺激CD8+ T细胞，从而促使它产生更多IFN-gamma。
从E可以看到，TMP1的四聚体标记的CD8+ T细胞百分比显著高于阴性对照。说明脾脏CD8+ T细胞中，大多都是识别TMP1抗原表位的T细胞。
总之，Fig1C将TMP1从众多多肽中挖掘了出来，并证明是TMP1导致了CD8+ T细胞产生IFN-gamma；Fig1E是证明了所有脾脏CD8+ T细胞中大多数都是特异性结合TMP1的T细胞）。也就是说C说明有TMP1在，T细胞会用更大量的武器对付肿瘤；而E则回溯了一步，说明用武器的士兵的确都是因为被TMP1刺激了才参与战斗（否则C就只说明TMP1会导致IFN-gamma产生更多，可是没说明这些T细胞到底是不是因为直接接受了到TMP1这个抗原表位）。

特异性抗原表位TMP1促进T细胞抗肿瘤作用（小鼠data）

Q1: 这部分工作做了什么，目的是什么？
A1: 从两个层面探索了抗原表位TMP1（刺激特异性T细胞）对肿瘤产生的影响：1. 预防性的（先接受TMP1，再接种肿瘤）；2. 治疗性的（先接种肿瘤，再接受TMP1）。

Figure 2A
TMP1和突变的TMP1-mut2、TMP1-mut3.

Figure 2B-C
想要探索TMP1-特异性 H-2Kb限制性T细胞能否预防性地影响tumor。因此，他们设计了一个实验。首先用不同的多肽（整个灭活的E.hirae 13144菌株（阳性对照），TMP1，第三位L突变为F的TMP1-mut3，之前找的一个无免疫原性的Group-1多肽（阴性对照））负载DC细胞，然后事先对没有接种肿瘤细胞的小鼠皮下注射DC细胞，最后再接种肿瘤并观察25天内肿瘤的大小变化。
B: 注射了DC细胞后，25天内肿瘤虽然也在增长但是受过负载E.hirae 13144的DC和TMP1负载DC的小鼠，肿瘤长的最慢。
C: 最后的肿瘤大小也是接受过负载E.hirae 13144的DC和TMP1负载DC的小鼠，肿瘤最小，且两者没有显著差异。

说明负载过TMP1的DC细胞对肿瘤发展有预防作用。

Figure 2D-E
想要探索生物工程引入TMP1是否可以逆转E.coli（已在Fig1A的实验中证实无效果）的治疗效果。因此，利用生物工程使得E.coli可以表达TMP1。
D: 使用的是Fig1A的实验流程。只是这次，选用的strain有E.hirae 13144（阳性对照），有表达TMP1、表达EGFP（阴性对照）、表达TMP1-mut2、和表达TMP1-mut3的E.coli。实验最后取出小鼠肿瘤观察大小，发现仅有表达TMP1的E.coli抑制肿瘤大小能力与E.hirae 13144没有显著差异。
E: 肽四聚体实验也表明，仅有表达TMP1的E.coli诱导的特异性T细胞与E.hirae 13144诱导的T细胞百分比没有显著差异。

说明表达TMP1，且只有表达TMP1的E.coli的治疗效果和E.hirae 13144无差。同时侧面与mut2、mut3的比较，也说明了位点2和3上氨基酸的重要性。

TMP1与肿瘤抗原表位的分子模拟机制（小鼠data）

Q1: TMP1是因为和小鼠中的什么肿瘤抗原相似，才增强了T细胞对肿瘤的反应？
A1: 通过NCBI blastp，找到在proteasome subunit beta type-4 (PSMB4)蛋白上氨基酸位置76-84的片段GSLARFRNI与TMP1的同源性相当高，且在MHC锚定位点一模一样。
Q2: PSMB4这个蛋白在肿瘤中表达如何？
A2: 它是许多cancers的致癌驱动基因。小鼠MCA205 sarcomas和TC1 lung cancer会过表达这个蛋白。但是有一些cancer（例如MC38 colon cancer）就不会（见Figure 3B），同时也发现这类癌症对CTX + E.hirae 13144的响应不好。
Q3: 如何说明PSMB4上的多肽GSLARFRNI影响肿瘤？（即GSLARFRNI是否真的是肿瘤抗原，在表型上是否会影响肿瘤发生？）
A3: 类似于TMP1 mut2和mut3的突变位置与类型，本文设计了PSMB4-mut2（GALARFRNI），PSMB4-mut3（GSFARFRNI）（Figure 3A），并用knock-in实验将突变导入到这个片段去。使用Fig1A的实验流程（day0-3使用广谱抗生素）发现，当突变PSMB4这个片段后，无论是mut2还是mut3小鼠使用CTX + E.hirae 13144效果与单用CTX，对MCA205 肿瘤大小的改变没有显著差异（Figure 3C-D）（即此时肿瘤抗原表位产生了变化，原有strain的TMP1表位引起的特异性T细胞对改变的肿瘤抗原不发生响应）。
同时，本文还探讨了一个实验，这回并不做广谱抗生素的处理，改为针对TC1 lung cancer。同样用knock-in在PSMB4中引入mut3突变。结果显示，相比于wdild type，mut3的CTX + E.hirae 13144对肿瘤影响与单用CTX没有显著差异（Figure 3E）。

Figure 3A
phage编码的抗原表位TMP1，肿瘤抗原表位PSMB4，突变了的肿瘤抗原表位PSMB4-mut2，突变了的肿瘤抗原表位PSMB4-mut3

Figure 3B
PSMB4在不同的癌症类型中表达不一致，MCA205和TC1都高表达，MC38则基本不表达。

Figure 3C-D
肿瘤中突变的PSMB4-mut2与mut3的小鼠，相比于未突变的PSMB4，使用CTX + E.hirae 13144的效果与单用CTX时，对MCA205 肿瘤大小的改变没有显著差异。

Figure 3E
肿瘤中突变的PSMB4-mut3的小鼠，相比于未突变的PSMB4，使用CTX + E.hirae 13144的效果与单用CTX时，对TC1 肺癌肿瘤大小的改变没有显著差异。

TMP1与肿瘤抗原表位PSMB4产生交叉反应（小鼠data）

思路（*）：要看是否真的有交叉反应，那就实际把其中一方抗原A的特异性T细胞拿出来，然后用另外一方抗原B刺激这些T细胞，如果诱导的效果和与A没有显著差异，那就可以说明出现了交叉反应，反之亦然。

Q1: 如何证明TMP1与PSMB4真的可以产生交叉反应？
A1: 根据思路（*），本文设计了两个四聚体来自TMP1的H-2Kb/TSLARFANI，以及来自PSMB4的H-2Kb/GSLARFRNI。然后取出经过CTX + E.hirae 13144治疗的小鼠的浸润到MCA205癌组织中的CTLs，找到那些能特异性识别上面两种四聚体的CTLs（他们发现双阳性的CTLs数目和仅识别PSMB4的CTLs数目一样多，暗示TMP1的特异性CTLs识别能力更广泛，PSMB4的特异性CTLs识别范围或成瓶颈）（Figure 4A）。接着用三种多肽来刺激这些CTLs（即阴性对照，TMP1多肽，PSMB4多肽），用ELISpot看他们产生IFN-gamma的变化值（TMP1多肽/阴性对照、PSMB4多肽/阴性对照）（Figure 4B）。
结果发现，TMP1四聚体筛选出来的CTLs被TMP1刺激后产生的IFN-gamma是阴性对照的5倍，但是同时被PSMB4刺激后也能达到阴性对照的2倍（Figure 4C）。反之，PSMB4四聚体筛选出来的CTLs，也是不仅会被自身对应多肽刺激，也会被TMP1刺激。

注意：CD3+标记指成熟的T淋巴细胞。

Figure 4A
设计四聚体，并筛选特异性的CTLs细胞。同时他们发现双阳性的CTLs数目和仅识别PSMB4的CTLs数目一样多。

Figure 4B
交叉反应的实验流程图。

Figure 4C
交叉反应的结果

Q2: 特异识别这两类四聚体的TCR（T细胞表位）都是什么样的？他们有什么交集？
A2: 将两者对应特异性CTL的TCR alpha和beta链种类进行比较。发现TMP1特异性CTLs的TCR类别更广（且广很多），且可以覆盖将近一半的PSMB4特异性CTLs的TCR类别。

补充：
TCR结构图

Figure 4D
特异性识别两类四聚体的TCR alpha链和beta链种类的交集

TMP1在肠道菌中的传播（小鼠data）

Q1: 因为TMP1在prophage上，这个TMP1是否有可能转移到其他菌上？可能性有多大呢？
A1: 将Fig1A实验结束的小鼠回肠物质进行培养分析，然后做PCR寻找TMP序列。每个小鼠提取7-18个细菌colonies（一共76个）。只发现Enterococcus gallinarum转移了E.hirae的phage（Figure 4E， 24/53的E.gallinarum发现了TMP序列）。同时，用透射电子显微镜发现1：10的E.hirae和E. gallinarum在培养基中找到了此有此phage经典形态的phage（空白对照则无）（Figure 4F）。以上结果都表明，编码TMP1 peptide的phage会在肠道菌中传播。

Figure 4E
对小鼠回肠物质培养分析发现E.gallinarum能测出TMP序列。

Figure 4F
透射电子显微镜观察到phage被E.hirae 13144产生并释放到基质中。

TMP上（其他）抗原表位与人体肿瘤抗原表位可以产生交叉反应（人data）

Q1: 在人体数据中，E.hirae 13144 phage分布的范围是怎样的？
A1: 在80%的粪便samples（<=150）中发现了E.hirae genome，同时发现E.hirae 13144 phage可以从母亲转移到婴儿。此phage也在缺少E.hirae core genome的样本中发现了。覆盖的基本都是Enterococcus genus，但是涉及species >= 3.
Q2: 在癌症病人中，TMP1与生存率的关系是怎么样的？
A2: 见Figure 4G。

Figure 4G
根据接受了PD-1抑制剂免疫治疗的NSCLC/renal cell cancer病人肠道中是否有TMP序列（存在于至少5个E.hirae和E. gallinarum中），将他们分成两组做生存分析。发现有TMP的病人总体生存期显著长于无TMP病人。但是发现只有34%的病人的TMP序列覆盖到了TMP1。

Q3: 以上提示了：有TMP序列能显著增长病人生存期，但是不一定是TMP1导致的（TMP1只占34%的比例）。那么人体中TMP还可能有什么抗原表位？
A3: 从TMP蛋白上设计出一些9肽，计算找到与人的MHC-I亚型——(HLA)-A*0201【猜测：选择这个亚型是不是因为是欧洲人常见亚型？】高亲和力的16个9肽。同时，体外实验从这16个中找到6个多肽是可以刺激CD8+ T细胞的IFN-gamma显著增加的。
Q4: 人体中的肿瘤抗原是谁？位于什么蛋白上？
A4: 使用NCBI blastp，将这些9肽比对到TCGA数据库寻找肿瘤上的homologs。发现只有一个9肽KLAKFASVV找到了对应肿瘤上的homolog（KLQKFASTV），它位于glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1-like (GPD1-L)蛋白上。且这个蛋白的高表达在头颈癌上与良好的预后相关联。
Q5: 如何证明TMP和GPD1-L抗原表位有交叉反应？
A5: 与前文类似，从志愿者的PBMCs细胞中利用四聚体技术筛选出HLA-A*0201限制性、phage多肽(KLAKFASVV)特异性的T细胞细胞系。此细胞系的clones可以识别GPD1-L的抗原表位（KLQKFASTV）。
Q6: 反向思维，是否可以用well-known、已证实、分化过程中不易突变的肿瘤抗原表表位，在gut microbiota中搜索其他的同源性多肽?
A6: 是的本文在公共数据集上找到了一些潜在的gut microbial抗原表位。

总结

在前期实验的研究结果提示下，本文利用小鼠模型，在肠道细菌基因组上找到了一段抗原表位（TMP1），它可以和MHC-I分子结合，从而诱导CD8+ T细胞反应，这些特异性的CD8+ T细胞可以与肿瘤抗原表位进行交叉反应，从而实现抗肿瘤的作用。首先，将TMP1进行定点突变，发现突变后对肿瘤的预防和治疗效果都不如TMP1，说明了TMP1序列一定的唯一性；其次，利用生物工程将TMP1导入E.coli中，与CTX联用，可以实现CTX + 表达TMP1 E.hirae 同样的治疗效果；第三，将肿瘤抗原表位（PSMB4抗原表位）从该蛋白中删除，再使用TMP1表达的strain，对治疗肿瘤无效（说明是TMP1与PSMB4的交叉反应介导了T细胞的杀伤肿瘤作用）；最后，将研究范围从小鼠模型扩展到人体数据上，发现携带了与GPD1-L抗原表位同源的TMP序列的病人对PD-1阻断治疗响应更好。

可改进之处

为什么只突变多肽的2个位点？能不能对TMP1上更多位点进行突变，看一下位点氨基酸对于免疫原性的贡献程度
能否通过点突变设计出更好的抗原表位，这样工程转移到E.coli上可以更好地激发免疫反应
人类与小鼠的TMP序列不完全一样（更多种类的多肽），但是都诱导了T细胞的抗肿瘤作用，是否是因为人体基因组更大更容易找到交叉反应的肿瘤抗原。
设计多个多肽的联用或工程导入，使得肿瘤突变后也仍然能与这些多肽产生交叉抗原反应。

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