NK细胞培养方法与优化解决方案

因NK细胞是一种比较难培养的细胞。培养过程会涉及很多问题，如：细胞接种密度如何？NK细胞有哪些特性？NK细胞具有哪些形态特征？......

使用的NK细胞培养套装为无饲养层细胞体外扩增技术，以外周血单个核细胞（PBMC）为起始种子细胞，结合多种细胞因子的诱导和刺激，实现NK细胞体外特异性的高效扩增。具有适用性强，对种子细胞的来源选择性好，不需包被；无饲养层培养工艺，简化操作，提高产品安全性；使用多种细胞因子及小分子物质联合刺激，充分活化效应细胞等技术优势。

试剂：NK细胞培养套装；

耗材：培养瓶；细胞培养袋；移液管；采血袋等。

（nk细胞培养试剂、耗材请微信搜索“泽平科技”公众号进行咨询）

操作过程：

D0：白细胞层分离培养及诱导

脐血经病毒检测合格后，送入实验室中。取70ml脐血，按常规的血浆及PBMC分离方法分离获得血浆和白细胞层。白细胞层经洗涤，计数为7.4*107，以1.5*106个/ml密度接种在培养瓶中。加入诱导培养基、因子及灭活血浆，放置在37℃，5%CO2的二氧化碳培养箱中培养。

注意事项：

1、脐血尽可能采集新鲜血液，否则容易凝血；

2、需注意Ficoll的温度，否则易混杂较多红细胞；

3、注意离心的升降速设置，否则无法获得白细胞层。

D2：显微镜下观察细胞生长状况：

细胞经诱导刺激，有明显的半贴壁聚团生长，部分细胞聚团悬浮生长。细胞略有增殖，增殖不明显。

20*物镜

D3：细胞观察并补充诱导培养基

细胞经过培养，半悬浮贴壁较D2增多，细胞聚团更为明显。

注意事项：前3天不能剧烈晃动细胞，避免干扰细胞成团。

10*物镜

D5：细胞观察并补充增殖培养基

经过两天的培养，半悬浮贴壁的细胞已开始悬浮于培养基中，培养基颜色变黄。细胞计数为1.1*106/ml，补充增殖培养基，刺激NK细胞增殖。

10*物镜

D7：细胞观察并补充增殖培养基

培养基颜色变黄，显微镜下可明显看到细胞聚团增大。细胞计数为2.0*106/ml，补充增殖培养基，调整细胞密度，刺激NK细胞增殖。细胞转移至培养袋中培养。略微吹打细胞，使细胞团略微分散。轻晃培养袋，使细胞分散培养。

10*物镜

D9：细胞观察并补充增殖培养基

培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，发现细胞已基本分散生长。细胞计数为1.5*106/ml，补充培养基。

10*物镜

D11：细胞观察并补充增殖培养基

培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，发现细胞已呈不规则形态，部分细胞有触角伸出。细胞计数为1.7*106/ml，补充培养基。

10*物镜

40*物镜

D12：细胞观察并补充增殖培养基（本次非常规补液）

培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，细胞形态与D11基本类似，取细胞进行流式细胞检测。细胞计数为1.5*106/ml，补充培养基。

流式细胞检测：CD3-/CD16+CD56+为82.74%

10*物镜

40*物镜

D12-NK细胞流式检测结果

D14：细胞检测

培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，取细胞进行流式细胞检测。细胞计数为2.0*106/ml。

流式细胞检测：CD3-/CD16+CD56+为90.98%

10*物镜

40*物镜

D14-NK细胞流式检测结果

(一)X-VIVO无血清造血细胞培养基

这个系列是属于化学成分限定培养基，为包括淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、外周血淋巴细胞(PBL)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在内的多种细胞提供营养完整和平衡的环境。此类培养基不包含任何外源性生长因子、人工促进细胞增殖的物质或未定义的补充物。它们不含任何蛋白激酶C刺激因子，适用于研究人类和小鼠淋巴细胞激活中的第二信使系统。

✍以下X-VIVO产品均已在FDA备案。

(二）UltraCulture培养基

✍UltraCULTURE™培养基（12-725F）是一种通用型无血清培养基，用于培养多种哺乳动物细胞类型。

✍UltraCULTURE™培养基主要由DMEM、F-12、重组人胰岛素、牛转铁蛋白和牛血清蛋白混合物（包括白蛋白）组成。

✍UltraCULTURE™培养基的总蛋白质浓度约为3mg / ml，不含L-谷氨酰胺，因此使用时每500mL培养基需要添加200mM的L-G（17-605）5mL。

✍UltraCULTURE ™培养基也已经在FDA备案。

✍培养多种哺乳动物的原代细胞和确立细胞株（包括单核细胞、巨噬细胞细胞系、上皮细胞和成纤维细胞；

✍UltraCULTURE培养基添加5%的胎牛血清也能够用于内皮细胞的培养）。（微信搜索“泽平科技”公众号进行咨询）

✍在杂交瘤形成期间促进细胞融合；

✍疫苗生产中促进病毒颗粒的产生；

✍可以添加防冻剂（12-132A）后在无血清环境冻存细胞。

注意：UltraCULTURE™培养基可能会出现浑浊，但不影响使用（使用过程中导致的污染不涵盖在内）。

（三）黄金组合系列

黄金组合-500mL UltraCULTURE ™（Lonza，12-725F）+10mL

Ultroser ™ G（Pall，15950-017）+5mL L-G（17-605E）

可用于多种干细胞（间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞）的培养研究。

参考文献（上下滑动查看）

（nk细胞培养试剂、耗材请微信搜索“泽平科技”公众号进行咨询）

[1] Miriam Y. Kim,et al(Cell,2018).Genetic Inactivation of CD33 in Hematopoietic Stem Cells to Enable CART Cell Immunotherapy for Acute Myeloid Leukemia.

X-VIVO 15添加5%人血清、青链霉素和谷氨酰胺培养筛选出的CD34+ T细胞，用含有CAR33构建体的慢病毒转染T细胞，敲除CD33基因，靶向AML细胞表面抗原，保留正常骨髓祖细胞的造血功能，从而治疗急性髓系白血病。

[2] Justin Eyquem,et al(Nature,2017).Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumourrejection.

X-VIVO 15添加5%人血清、200U/mL IL-2培养CD3/CD28激活的T细胞，用CRISPR/Cas9将CD19特异性CAR基因靶向导入TARC位点，可增强抗肿瘤效果。

[3]Jang Hwan Cho(2018).Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses.

UltraCulture添加2mM L-G、200U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠、5mM丁酸钠培养转染后的HEK293制备慢病毒，收集病毒后，接种到用X VIVO 15培养的T细胞进行后续实验。

[4] Nathalie Meuleman (2006).Human marrow mesenchymal stem cell culture: serum-free medium allows better expansion than classical a-MEM medium.

UltraCulture 添加2% Ultroser G（PALL）、2mML-G、1%抗生素-抗真菌药培养MSC，培养的细胞数量和细胞的多功能性均比添加15%FBS的α-MEM好。

[5] Oksana Lockridge(2018).Comparison of Hupresin® to procainamide-Sepharose for purification of butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase

培养CHO，用于表达部分糖基化人丁酰胆碱酯酶;

[6]Hua-Jiang Dong(2017).The Distribution of Transplanted Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Large Blood Vessel of Rats With；用于培养人脐带间充质干细胞;

[7]Ming Zhu, (2017).Curcumin protects mesenchymal stem cells against oxidative stress-induced apoptosis via Akt/mTOR/p70S6K pathway.用于大鼠来源MSC的培养.

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