上皮细胞培养方法及优化解决方案

上皮细胞培养

1）表皮细胞培养

1．取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5～1 平方厘米小块。

2．EDTA 处理：先置入0.02％EDTA 中室温置5 分钟。

3．冷消化：换入0.25％胰蛋白酶中，置4℃过夜。

4．分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。

5．温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30～60 分钟。

6．用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。

7．培养液：通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20％小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2 温箱培养。

2）乳腺组织培养

直接培养法：（适于培养含纤维少的软组织）

1．在含有少量培养液或Hanks 液的容器中，用锋利刀片将组织反复切割成碎块。

2．把组织碎块连同液体注入离心管中，再补加少许培养液，用吸管吹打片刻，置试管架3～5 分钟。吸除上层液可排除非乳腺细胞部分。重复2～3 次。

3．末次处理结束后，向沉降管中再补加培养液，用吸管稍吹打，使沉降物重悬。不待细胞团块下降立即通过3～4 层无菌纱布滤入另管中。

4．调整好适宜密度，接种入培养瓶中培养。
胶原酶消化法：（适于处理含纤维多的较硬组织）

其过程与培养其它组织相同。

3）胃上皮细胞培养

1．取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许。

2．清洗：用含庆大霉素（400 微克/毫升）和二性霉素（2 微克/毫升的Hanks）液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm3 大小。

3．消化：在I 型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消化80 分钟。

4．离心：收集细胞悬液，800 转/分离心后，Hanks 液漂洗两次。

5．接种：末次离心后加入含有1％～2％胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中，接种量依不同实验目的而定。

4）肝细胞培养

初代组织块培养：
取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3 左右的小块，采用帖壁培养法。

初代消化法培养：

1．把肝组织切成2～4 立方毫米的小块，用不含钙镁的BSS 液洗两次。

2．移入1：1 的0.1％胰蛋白酶和0.1％胶原酶（都用无钙镁BSS 配置）中，4℃冷消化10～12 小时后，通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过。

3．收集细胞、BSS 液洗1～2 次、计数、接种培养。

消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法（肝脏灌流需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好）：

1．无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS 洗除血污。

2．取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入肝管系统，并不时轻揉压肝脏，以便消化液进入肝小叶中；消化液在肝内停留20～30 分后，在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出。

3．待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用RPMI 1640 培养基培养（较其它培养基为好），能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。

传代培养：

待细胞生长连接成片后，用BSS 洗一二次，加1：1 的0.025％胰蛋白酶和0.02％ EDTA 混合消化3～5 分钟，待细胞回缩，便停止消化，弃掉消化液，用BSS洗一二次，注入营养液，吹打，制成细胞悬液，再接种培养。

5）内皮细胞培养

1．取产后的新鲜脐带。如不立即培养可以保存于4℃中，但不宜超过12 小时。无菌剪取长10～15 厘米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用于培养。

2．先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的静脉中，洗除残血，注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流。

3．用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1％的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，消化3～10 分钟。

4．吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中，为获取更多细胞，可再注入温PBS 冲洗2～3 次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心。

5．吸除上清，加1640 培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养，顺利时2～3 天内细胞即可长成单层。

6）毛细血管内皮细胞培养

肿瘤条件培养基制备：

1．取C3H 小鼠的S-180 实体肉瘤组织。

2．胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良Eagle 氏培养液15ml（含10％小牛血清），接种到T-75 Falcon 产培养瓶中培养。

3．在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；再用含10％小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，可获得多量条件培养基。

4．4000 转/分离心后，再通过0.22μm 微孔滤膜滤过，－20℃冻存备用（临用前融解）。

初代培养：

1．取材：取新鲜牛肾上腺数个，先用Hanks 液洗除血污。

2．剥除被膜，分离出皮质，切成1 立方毫米小块，加0.5％胶原酶室温中消化1 小时，每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分。

3．通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段。

4．650rpm，4℃，离心7 分钟后，弃掉上清胶原酶。

5．沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再离心，共两次。

6．末次沉淀物仍用含有10％小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培养液重悬后，稍吹打。

7．接种于铺有明胶底层的培养皿中，37℃培养，在培养头1～3 小时中，毛细血管小段和内皮细胞最先帖附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮。

8．趁此时，吸除培养液，再加入肿瘤条件培养液，每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1～4 个内皮细胞，以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，能持续2～5 天。

毛细血管内皮细胞分离培养：

1．初代培养2～3 天后，镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈圈起。

2．镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显微细针在倒置显微镜下挑除。此操作用细胞解剖器或用手操作均可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行，但时间不宜过长（15～20 分钟），圈内非内皮细胞可用无菌胶刮除。

3．用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞。

4．剩余内皮细胞岛如小（5～20 个细胞）而少时，生长增值变得缓慢或不完全不生长，此时需加入3T3 等饲细胞，饲细胞接种量为4000 细胞/cm2。

5．当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基。

6．接种入明胶底物皿中继续培养（饲细胞死亡淘汰），细胞增殖生长汇合后，按1：5 传代。

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