2020.9.12丨变异检测的原理应用方向

变异检测的原理&技术要点
- 定义：变异检测是指通过测序技术对某一物种个体或群体的基因组进行测序及差异分析，获得单核苷酸多态性SNP ）、插入缺失 InDel ）、结构变异（ SV ）、拷贝数变异CNV ）等大量的遗传变异信息用于开发分子标记建立遗传多态性数据库，为后续揭示进化关系、挖掘功能基因等奠定数据基础。
- 按照片段大小分类：
  - 单碱基：SNP
    - SNP （单核苷酸多态性）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换等。利用 GATK软件对群体数据进行变异检测及过滤，进一步过滤 SNP 的 reads 支持数小于 4 的位点，得到高可信度的 SNP
  - 1-50bp：InDel
    - InDel 是指基因组中小片段的插入和缺失序列，其长度在 1 50bp 之间。我们采用 GATK 软件进行个体 InDel 的检测。 Small InDel 变异一般比SNP 变异少，同样反映了样品与参考基因组之间的差异，并且编码区的 InDel 会引起移码突变，导致基因功能上的变化。
  - 50-1000bp：SV
    - SV
      - （结构变异）指基因组水平上大片段的插入、缺失、倒置、易位等序列。可利用 Lumpy, Manta, Delly 软件，基于 pair endreads 比对到参考基因组上面的关系及实际 insert size 大小检测样品与参考基因组间的插入（ insertion INS ）、缺失 deletionDEL ）、倒置 inversion INV ）、染色体内部迁移 intra chromosomal translocation ITX ）、染色体间的迁移 interchromosomal translocation CTX 。
  - 大于1000bp：CNV
    - 拷贝数异常
    - (copy number variations, CNVs 是属于基因组结构变异（ structural variation ），根据大小可分为两个层次：显微水平microscopic ）和亚显微水平 ( 。显微水平的基因组结构变异主要是指显微镜下可见的染色体畸变 , 包括整倍体或非整倍体、缺失、插入、倒位、易位、脆性位点等结构变异。亚微水平的基因组结构变异是指 DNA 片段长度在 1Kb 3Mb 的基因组结构变异 , 包括缺失、插入、重复、重排、倒位、 DNA 拷贝数目变化等，这些统称为 CNV （也称为拷贝数多态性 (copy number polymorphisms, CNPs ）。
- 名词解释
  - 测序深度：测序得到的总碱基数与基因组大小的比值。
  - 覆盖率：指测序获得的序列占整个基因组的比例，与测序深度正相关。
  - 比对率（ mapping rate ））：反映了样本测序数据与参考基因组的相似性需要 70 %%，最好
  - 90% 以上。
二、三代变异检测简介&应用方向
- 简介
  - 全基因组重测序（WGS ））：对基因组序列已知的个体进行全基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
    - 优势：获得的基因组信息全面，高分文章青睐，循环使用性高
    - 不足：成本高
  - 简化基因组测序：指用限制性内切酶对基因组进行简化，只对酶识别位点相关的 DNA 进行高通量测序。
    - 优点：快速、简便、低成本
    - 不足：
    - 1) 只能获得 SNP 等信息， SV 、 CNV 检测可靠性较低
    - 2) 用酶切的片段进行测序，基因组覆盖度低，获得变异信息不全
    - 3) 建库前需要进行酶切评估，建库分析结果，受酶切评估结果和基因组组装质量所限
    - 4) 多数应用在影响因子 5 分以下的期刊，如 BMC 、 Plos one 等
  - 检测数据量推荐：检测 SNP 5 10 × ；检测 InDel 10 15 × SV 15 20 × CNV 30 ×
- 检测分析流程
  - 流程图
  - 流程推荐软件
    - 分析流程：使用软件
    - 数据质控：Fastqc
    - 比对：BWA
    - SNP、 InDel 检测：GATK
    - SV检测： Manta、 Delly
    - CNV检测：CNVnator
    - 注释：ANNOVAR
    - 圈图绘制：Circos
- 应用方向
  - 基于二代测序检测到的SNP 位点，后续可分别做群体进化、 GWAS 、 BSA 、遗传图谱，具体的应用方向如下所示：
- 优势和短板
  - 三代优势
    - 长读长
      - 处理重复区域；
      - 提供连续的基因组装配；
    - 均衡的测序覆盖度
      - 没有偏好性 (GC%, 序列复杂度
      - 能够进行完整基因组测序；
    - 无测序系统偏差
      - Random errors wash out in final consensus 在最终的一致性序列中，去除了随机错误
      - 提供准确的基因组序列。
  - 二代短板
    - 读长短：导致组装不完全无法跨越重复序列
    - 覆盖度不均一；G/C 或 A/T 富含区域是重灾区无法达到真正意义上的全
    - 基因组测序；
      - 扩增等因素导致系统错误（指测序的准确率
      - 适用于 SNP 检测不适用大范围的结构变异检测
- 三代检测类型
  - CLR与CSS
    - 图示
  - 两种测序模式对比
  - CLR检测SV
    - CLR检测SV数据量推荐
      - 构建 CLR 文库， 15 30 × 测序深度时， SVs 检测准确度和检出率在 80 85%
      - 对于大片段 SV 检出率、准确度更高。
      - 图示
    - CLR检测SV混样的可行性
      - 图示
    - CLR检测SV分析流程
      - 图示
  - HiFi变异检测SNP、InDex
    - SNV检测 15 × 可检测到 99.5%的变异，至少需要 10 ×；
    - InDel 17 × 可检测到与 NGS 相当的变异（90% ）；
    - SV 检测15 × 检测到 95% 的变异。
    - 文献参考
      Accurate circular consensus long
      read sequencing improves variant detection and assembly of a human genome 2019 Nature Biotechnology
    - 分析流程
      - 图示
总结
- 1.与 CLR 相比， HiFi 检测到的SV 边界更好，断点更明显；
- 2. CLR 变异一般用于检测 SV可以和二代数据联合起来；HiFi 可检测 SNP 、 InDel 、SV 等；
- 3. CLR 检测推荐测序深度 30 ×以上； HiFi 推荐 15 × 的测序深度。
- 思路一：有参考基因组
  - CLR ：长读长的优势，碱基准确度相对较差的劣势，建议三代数据检测并结合二代数据进行纠错
  - CCS HiFi ：较高的碱基准确度，可同时检测 SNP/ InDel /SV ，无需二代数据校准
  - 可基于长读长对基因组补 gap ，获得更精确信息。
- 思路二：无参考基因组
  - CLR ：组装参考基因组
  - CCS HiFi ：较高的碱基准确度，更有利于分型与重复区域的组装，更节省时间周期
  - 组装完成后，基于所测二代和三代数据进行结构变异检测，提高数据利用率。

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