怎么检测细胞是否受支原体污染?

测过程

待测样品的准备：
为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品需要取自换液后培养2-3天且汇合度在90%左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，让细胞生长2-3天再取培养液进行检测。可以按照以下两种方法之一进行样品的前处理：
方法一（该方法无法去除可能的干扰物，显色被干扰的可能性相对较大）：
（1）取150 μL上述待测样品到1.5 mL离心管内，在普通台式离心机上1000 rpm (大约150 g)低速离心5 minutes，取离心后的上清100 μL用于支原体检测，丢弃下层剩余的50 μL（含细胞沉淀）。
（2）已经离心去除细胞的待测样品可以直接检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定），具体如下：95 ℃加热处理5 minutes（可以转移到PCR管内，在PCR仪上进行加热处理），简单离心（1000 g，5 seconds）后，取上清进行检测。

方法二（推荐。该方法不仅可以浓缩支原体从而提高检测的相对灵敏度，还可以去除绝大部分可能的干扰物，显色被干扰的可能性极小）：
（1）根据浓缩倍数，可以取100 - 1500 μL上述待测样品到1.5 mL离心管内，在普通台式离心机上1000 rpm (大约150 g)低速离心5 minutes，将离心后的上清转移到另一个离心管内，丢弃细胞沉淀。
（2）将上清继续13000 rpm（约16000 g）高速离心5 minutes，小心吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.5（样品可以长期保存。推荐）或者去离子水（样品比较不稳定，只适合当天或短期内检测使用）重悬沉淀（沉淀中含有支原体），吹吸均匀【如果最初使用了1500 μL的样品，则支原体浓度大约提高了30倍】。
（3）该重悬后的样品可以直接检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定）。热处理具体如下：95 ℃加热处理5 minutes（可以转移到PCR管内，在PCR仪上进行加热处理），简单离心（1000 g，5 seconds）后，取上清进行检测。
 注1：这里的细胞培养上清不是指细胞经胰酶消化后的离心上清，而是指至少培养2天后的贴壁细胞培养液上清（不需要胰酶消化，也不能取经胰酶消化后的离心上清进行检测）或悬浮细胞培养液。
 注2：本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞，以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g，该离心力下，哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会。如果错误使用更高的离心力将可能导致支原体也被离心下来，从而导致假阴性。
 注3：收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测，请放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月，在-80℃可以长期保存。此外，为了节约检测成本，可以将不同时间收集的样品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起检测。
 注4：如果预期待测样品支原体含量较少（比如，低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等），可以采取措施以提高检测的灵敏度，具体方法请看后文注意事项部分：如果提高本试剂盒检测灵敏度。

反应体系的配制【本步骤所有操作强烈建议使用进口滤芯吸头（比如Axygen滤芯吸头）进行操作，以避免试剂被污染。操作之前，请认真看完后文的注意事项后，再进行操作】：
（1）将溶液1和溶液3从-20 ℃冰箱中取出，室温融化后，开盖之前，甩动溶液1的离心管将管壁溶液甩到管底，而溶液3必须高速离心（5000 rpm，离心1分钟）一下，吹吸均匀后【注：溶液1和溶液3每次融化后都必须吹吸均匀后再吸取，溶液2和溶液3开盖之前，请高速离心一下】，按表1进行反应体系的配制：

表1：恒温反应体系的配制

 举例：1）如果待测样品为8个（加上1个阴性和1个阳性对照），则样品总数为10个。溶液1的总体积为23×10×1.06=243.80 μL。溶液2的总体积为1×10×1.06=10.60 μL。溶液3的总体积为0.15×10×1.06=1.59 μL。将溶液1、溶液2和溶液3混合均匀即可。2）如果打算一个试剂盒一次使用完毕，可以按照以下方法进行配制：直接往整管溶液1（1150 μL）中加入50 μL 溶液2和7.5 μL溶液3，混合均匀即可。如果一次使用完毕，一个试剂盒大概可以检测48-49个样品。
 注：1）总体积中多配制6%（客户如果觉得该比例不合适，可以自己调整），是为了防止移液误差，以保证每个反应管中的反应液足量；2）溶液1和溶液3使用完后，请继续放回-20 ℃冰箱中保存；3）溶液2必须一直在-20 ℃冰箱中保存【溶液2在-20 ℃不会冻住】，不能放于室温；4）溶液2和溶液3开盖之前，请高速离心一下。
（2）将上述配制好的恒温反应体系，吹打均匀后，按每管24 μL分装到0.2 mL的PCR管中。
 注：1）尽量保证每管的反应液体积一样。如果分装时最后一管反应液不足，可以将其作为阴性对照管；2）PCR管应该使用透明度良好的PCR管。
（3）阴性对照管（Negative）可以不加，也可以加入1 μL灭菌水（建议不加）；往测试管（Test）中加入1-2 μL待测样品（前处理使用方法一的，建议加1 μL；前处理使用方法二的，建议加2 μL）；往阳性对照管（Positive）中加入1 μL阳性支原体DNA。反应液的总体积为25 μL。
 注：1）装有阳性支原体DNA的螺口管请不要高速离心，开盖之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，请吹吸均匀后再吸取。如果不小心高速离心了，务必吹吸均匀后再吸取，否则阳性对照结果可能异常。2）进行反应体系配制的房间，与样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间最好分开。

反应（选择以下方式之一进行反应）：
（1）水浴内反应（注意：本产品只能使用含水的普通水浴锅，不能在没有水的纯金属浴内反应，因为没有水的纯金属浴温度非常不准确。）：往每个反应管内加入25 μL矿物油，以防止水份挥发，盖上盖子，将反应管插入带孔的漂板内，放入已经升温到60℃的普通水浴内，准确反应60分钟。
 注：在反应之前，水浴锅必须先升温到60℃，再放入反应管。此外，必须用水银温度计测量水温，确保水浴锅的温度准确。本试剂盒所用的酶对温度非常敏感，只允许仪器显示温度与实际温度的温差不超过1℃。
（2）PCR仪上反应：有PCR仪的实验室，强烈建议在PCR仪上进行反应，这样可以准确控制反应的时间和温度。PCR仪参数如下：60℃，60 min；10℃, forever；热盖温度，105 ℃。
 注：在带热盖的PCR仪上进行反应，无需在反应管内加入矿物油（现在的PCR仪基本都是带热盖的）。
结果判断：60℃反应60分钟后，立刻取出反应管，放于室温。以一张白纸或白色泡沫盒（优选白色泡沫）为背景，通过反应管溶液颜色的变化，即可判断检测结果。如果溶液为蓝绿色，则说明有支原体污染；如果为紫红色，则说明没有支原体污染（如图1）。
 注1：在60℃反应的时间必须准确计时，超过说明书规定的反应时间可能会出现假阳性（最多不得超过5分钟）。如果试剂盒已经过期或者发生其他意外情况影响酶活性时，万一发现：60℃反应60分钟后，阳性和阴性颜色区别不明显，可以考虑将已经反应60分钟的反应管，继续在60℃的水浴或PCR仪上反应10分钟。但是如果60℃反应60分钟后，阳性与阴性的区别一眼就可以看出，不得继续反应，否则可能出现假阳性。以上只是意外情况下的补救措施。
 注2：如果反应后，发现个别样品的颜色介于阳性和阴性之间（这种情况概率很低。如果经常出现，样品中可能含有可干扰正常指示效果的物质，必须先去除。去除方法见后文注意事项部分），可以将这些样品继续60℃反应10分钟。10分钟后，如果其颜色仍然与阳性对照的颜色不同，该样品应该判为阴性。这种可疑样品建议用相同试剂盒或者不同原理的其他试剂盒（如本公司的《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》）进行复检。
 注3：反应后，请勿打开反应管的盖子，否则有可能造成检测环境的污染。结果判断完后，将其用自封袋密闭，扔到另外一个房间的垃圾桶内。
 注4：不同批次的产品，以及由于拍照等原因，反应后阳性对照和阴性对照的颜色可能会与本说明书书图1的颜色略有差异（比如阴性对照颜色可能呈现浅红色或紫红色）。只要反应后阳性对照与阴性对照的颜色有显著区别，就说明反应成功

注意事项

    请确保样品加入后，反应之前：阴性、阳性和所有待测样品的颜色基本一致。如果个别样品，一旦加入，反应管的颜色就与阴性、阳性明显不同，说明其中含有可干扰本系统正常指示效果的物质，必须先去除。此现象曾经在检测CHO无血清培养基和一些血液制品（比如：白蛋白溶液、血浆原液、血清原液等）上发生过。常见的DMEM、MEM、F12、1640等培养基（可以含10%血清）一般不会发生该现象。去除方法：（1）离心清洗：取1 mL细胞上清或待测样品（比如：白蛋白溶液、血浆原液、血清原液），先13000 rpm离心5 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次离心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次离心，吸走全部上清，用50 μL 10 mM Tris-HCl, pH 8.5（样品可以长期保存。推荐）或者去离子水（样品比较不稳定，只适合当天或短期内检测使用）重悬沉淀，吹吸均匀。该重悬后的样品可以直接检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定）。热处理具体如下：95 ℃加热处理5 minutes（可以转移到PCR管内，在PCR仪上进行加热处理），简单离心（1000 g，5 seconds）后，取上清进行检测。由于离心清洗可能导致支原体部分丢失，如果样品支原体含量很低，可能导致漏检。（2）使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》提取支原体DNA后进行检测，这是最可靠的方法。通过DNA提取，即可以将所有可能的干扰物质全部去除，又可以将支原体DNA浓缩10-100倍。

    由于恒温扩增所用的各种酶强烈依赖溶液中的二价离子，待测样品的EDTA等金属离子螯合剂只能微量存在。如果打算用试剂盒提取支原体DNA（推荐使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》），请用去离子水或者不含EDTA的5 mM Tris.HCl（pH 8.0-8.8）的缓冲液洗脱和溶解DNA。

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    防DNA污染注意事项：
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（1）恒温反应体系配制的房间（本试剂盒请在有窗户、通风良好的普通房间操作。请勿在密闭的细胞培养间进行该步骤的操作，因为细胞培养间支原体污染概率很高），与用于样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间一定要分开。
（2）强烈建议使用滤芯吸头（比如Axygen滤芯吸头）吸取相关溶液和阳性支原体等。如果没有滤芯吸头，至少应该使用新开封的吸头。
（3）必须确保使用的移液枪本身没有残留的支原体。因此，最好使用全新购买的移液枪。如果没有新购买的移液枪，至少应该使用以前没有进行过细胞培养的移液枪。因为进行过细胞培养的移液枪极有可能被含支原体的培养液污染（如细胞培养时，不小心将含支原体污染的培养液吸入移液枪的枪体内）。移液枪中吸附的支原体有可能造成不必要的假阳性。
（4）样品前处理的各类吸头、离心管，以及吸取阳性对照DNA、待测样品DNA的吸头，务必小心处理，请将其装入含有半瓶水的带盖的、可密封的瓶子内，全部样品吸取完后，盖上瓶盖，以防止阳性DNA的挥发，造成环境的污染，进而造成假阳性。
（5）整个操作过程，最好不要说话，因为人的口腔和唾液都是带支原体的。
（6）反应后，请勿打开反应管的盖子，否则有可能造成检测环境的污染。结果判断完后，将其用自封袋密闭，扔到另外一个房间的垃圾桶内。
4. 本试剂盒的检测准确率：（1）由于本试剂盒能识别的支原体大概只占了污染细胞的支原体的99%左右，还有1%左右的污染细胞的支原体有可能不认识，这可能会导致1%左右的假阴性（漏检）。（2）由于人体的口腔、皮肤和尿道都是含有支原体的，而且常用的肿瘤细胞系支原体污染率非常高，一般在15-90%之间，导致实验室环境甚至移液枪也经常含有支原体，这可能导致出现极个别的假阳性（多检，正常这种概率应该低于1%）。总体来说，单独使用本试剂盒有可能出现1-2%左右的错误率（注意：细胞培养中支原体出现的概率是来自文献数据，是大量体外细胞培养支原体污染调查的结果。如果你们实验室细胞污染的恰巧是出现概率比较低而本试剂盒又不认识的支原体，漏检的概率会大幅度上升。因此：对所有重要的样品（比如，可能用于人体的细胞），不能只依靠本试剂盒就下最终检测结论，必须至少同时使用另外一种支原体识别率为100%的支原体检测试剂盒【比如本公司《PCR法支原体检测试剂盒》或《探针法支原体检测试剂盒》】进行检测，互相验证！）。为了提高检测的准确率，建议客户采取以下两种措施：第一，对所有本试剂盒检测出的阳性样品，利用本试剂盒或者其他不同原理的支原体检测试剂盒进行复检（复检可以基本排除因环境污染导致的假阳性），或者检测时所有样品直接使用两个反应管同时检测检测，只有同一个样品两个反应管的检测结果都为阳性时，才能判断为真正的阳性样品。第二，对所有重要的样品（比如，可能用于人体的细胞），必须至少同时使用两种（甚至三种）不同原理的支原体检测试剂盒（其中一种方法推荐使用支原体识别率为100%的《PCR法支原体检测试剂盒》或《探针法支原体检测试剂盒》）进行检测，互相验证。
5. 如发现细胞被支原体污染，本公司提供细胞专用支原体清除和预防试剂，以及水浴专用杀菌剂和环境专用杀菌剂。
6. 支原体检测样品可以分成两类：第一类，用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液，由于该条件非常适合支原体生长，培养数天后，支原体密度一般较高，可达107-9/mL，可以直接检测。第二类，低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品，由于这些样品即使有支原体污染，支原体含量一般很少，直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测，往往检测不出来。这些样品建议：（1）对样品的支原体进行离心浓缩或者使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》将支原体DNA浓缩提取，该两种方法大约可以将检测灵敏度继续提高10-100倍。该方法速度快，当天出结果，但是可靠性不如后面的培养法。（2）使用支原体液体培养基（必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基）培养3-7天后，再进行检测。具体方法请参考本公司《发光法支原体检测试剂盒》说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢，需要3-7天，但是可靠性高。
7. 如何提高本试剂盒检测灵敏度：如果预期待测样品支原体含量较少（比如，低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等），可以采取以下几种措施：（1）通过使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》，将支原体DNA浓缩提取后再进行检测（提取过程还可以把所有可能的PCR抑制剂全部去除），大约可以将检测灵敏度提高10-100倍。（2）对支原体进行离心浓缩：取1 mL细胞上清，先13000 rpm（约16000 g）离心5 minutes，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.5 重悬沉淀，95 ℃加热处理5 minutes，简单离心后（1000 g，5 seconds），取上清进行检测。该离心浓缩过程大约可以将检测灵敏度提高20倍。

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