简介

MetaPhlAn2是分析微生物群落(细菌、古菌、真核生物和病毒)组成的工具，它在宏基因组研究中非常有用，只需一条完命令即可获得微生物的物种丰度信息(扩增子物种组成需要质控、拼接、拆样本、切除引物、比对等步骤，此软件居然分析宏基因组这么方便)。同时配合自带的脚本可进一步统计和可视化。

主页：http://segatalab.cibio.unitn.it/tools/metaphlan2/

MetaPhlAn2可以基于宏基因组数据，获得微生物群体中种水平精度的组成，包括细菌、古菌、真核生物和病毒。如果有株水平基因组的物种，也可以追踪和研究。

MetaPhlAn2整理了超过17000个参考基因组，包括13500个细菌和古菌，3500个病毒和110种真核生物，汇编整理了100万+类群特异的标记基因，可以实现：

• 精确的分类群分配

• 准确估计物种的相对丰度

• 种水平精度

• 株鉴定与追踪

• 超快的分析速度

软件 2015年发表于Nature Method，截止18年4月21日Google Scholar统计引用183次。该软件通讯作者为意大利特兰托大学的助理教授Nicola Segata的计算宏基因组实验室，己发表68篇文章，发表和维护的软件有14个，其中著名的有MetaPhlAn2, GraPhlAn, LEfSe, ShortBRED, MicroPITA, HUMAnN等。如果你对他不熟悉，那一定听説过他的博后老板Curtis Huttenhower(Picrust, Lefse通讯作者)。

实验室主页: http://segatalab.cibio.unitn.it

看看软件主要能干什么

分析人类微生物组数据，微生物和样本进行层级聚类

人类微生物组数据多时间点普氏菌属株水平的指纹

软件安装

优秀的是软件是一直在更新维护的，几年都没更新的软件，如果还有更好的选择就不建议使用。

此软件一直在更新维护，最近一次更新是两周前。

软件仓库：https://bitbucket.org/biobakery/metaphlan2/overview

依赖关系说明

软件依赖python2.7+和numpy包，同时居然支持python3。

如果使用Bowtie2结果为输入文件，则无任何依赖关系。

utils/metaphlan_hclust_heatmap.py脚本绘制热图时，依赖matplotlib包

如果想输出biom格式结果，需要安装R包biom

结果的进一步可视化，如使用hclust2和GraPhlAn请参考相关软件安装说明

下载和安装代码

请学习时下载安装最新版，如下代码仅为本文章作者学习此软件时的版本，仅供参考。主要包括下载、解压、添加环境变量。

wget https://bitbucket.org/biobakery/metaphlan2/get/default.zip
unzip default.zip
mv biobakery-metaphlan2-5175d8783801 metaphlan2
cd metaphlan2/
export PATH=`pwd`:`pwd`/utils:$PATH
export mpa_dir=`pwd`
metaphlan2.py -v # MetaPhlAn version 2.7.6    (5 March 2018)

使用实例

定量物种谱

大家都知道扩增子分析前期处理步骤复杂，宏基因组分析应该更复杂，但此软件却是例外，操作简单，一条例命令从原始数据拿到物种谱(相当于标准化后的OTU表)。是不是很牛B。

而且作者考虑了不同用户的需求，有多种使用情况下都可用，下面多种方法根据自己的输入文件格式任选其一。

如果输入文件是fastq，需要依赖bowtie2安装好

metaphlan2.py metagenome.fastq --input_type fastq > profiled_metagenome.txt

推荐输出bowtie2的比对结果，方便下次快速重新计算，并使用多线程-nproc

metaphlan2.py metagenome.fastq --bowtie2out metagenome.bowtie2.bz2 --nproc 9 --input_type fastq > profiled_metagenome.txt

也可以使用bowtie2输出文件

metaphlan2.py metagenome.bowtie2.bz2 --nproc 5 --input_type bowtie2out > profiled_metagenome.txt

也可以分别进行比对和定量

bowtie2 --sam-no-hd --sam-no-sq --no-unal --very-sensitive -S metagenome.sam -x ${mpa_dir}/databases/mpa_v20_m200 -U metagenome.fastq
metaphlan2.py metagenome.sam --input_type sam > profiled_metagenome.txt

最常用的是使用双端压缩fastq文件，但并不考虑配对信息

metaphlan2.py --input_type fastq <(zcat metagenome_1.fq.gz metagenome_2.fq.gz) > profiled_metagenome.txt

最好调用多线程，并输出比较结果

metaphlan2.py --bowtie2out metagenome.bowtie2.bz2 --nproc 9 --input_type fastq <(zcat metagenome_1.fq.gz metagenome_2.fq.gz) > profiled_metagenome1.txt

第一次使用，程序会自己下载数据库至安装目录中，并进行校验、解压、解压、bowtie2建索引，根据网速和服务器性能可能需要很长时间1-N小时。

输出结果为各层级物种相对丰度值，有点像lefse的输入文件格式(方便lefse下游差异分析)

#SampleID    Metaphlan2_Analysis
k__Bacteria    100.0
k__Bacteria|p__Actinobacteria    49.91104
k__Bacteria|p__Proteobacteria    46.00995
k__Bacteria|p__Firmicutes    2.45456
k__Bacteria|p__Bacteroidetes    0.99062
k__Bacteria|p__Cyanobacteria    0.63383
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria    49.91104
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Alphaproteobacteria    22.82115
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Betaproteobacteria    16.60788

多个样品批处理

假如我们有25-28一共4个样本，调用for循环并转后台并行处理

cd ~/project
for i in `seq 25 28`;do
metaphlan2.py --nproc 9 --input_type fastq <(zcat Sample_${i}.rmhost.1.fq.gz Sample_${i}.rmhost.2.fq.gz) > metaphlan2_${i}.txt &
done

个人使用上面命令处理输入文件为压缩格式fastq时，偶尔会出错，帮修改为下面两步法分别比对和生成表格，更保险

for i in `seq 25 28`;do
bowtie2 -p 9 --sam-no-hd --sam-no-sq --no-unal --very-sensitive -S temp_${i}.sam -x ~/software/metaphlan2/databases/mpa_v20_m200 -U Sample_${i}.rmhost.1.fq.gz,Sample_${i}.rmhost.2.fq.gz &
donefor i in `seq 25 28`;do
metaphlan2.py temp_${i}.sam --input_type sam > metaphlan2_${i}.txt &
done

样品物种谱合并

merge_metaphlan_tables.py命令可以将每个样品结果表合并，程序位于程序的utils目录中，请自行添加环境变量或使用绝对路径。合并时支持输入文件多个文件空格分隔，或使用通配符(如下)。可结合sed删除样本名中共有部分，精简样品名方便可视化简洁美观

merge_metaphlan_tables.py metaphlan2*.txt | sed 's/metaphlan2_//g' > merged_metaphlan2.txt

获得了矩阵表，下面可以进行各种统计分析与可视化啦！

ID    25    26    27    28
#SampleID    Metaphlan2_Analysis    Metaphlan2_Analysis    Metaphlan2_Analysis    Metaphlan2_Analysis
k__Bacteria    100.0    100.0    100.0    100.0
k__Bacteria|p__Actinobacteria    49.91104    45.2479    54.37222    48.77918
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria    49.91104    45.2479    54.37222    48.77918
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria|o__Actinomycetales    49.53809    44.96297    54.09146    48.77918
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria|o__Actinomycetales|f__Cellulomonadaceae    0.08247    0.064    0.0    0.0
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria|o__Actinomycetales|f__Cellulomonadaceae|g__Cellulomonas    0.08247    0.064    0.0    0.0
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria|o__Actinomycetales|f__Cellulomonadaceae|g__Cellulomonas|s__Cellulomonas_unclassified    0.08247    0.064    0.0    0.0

绘制热图

metaphlan_hclust_heatmap.py -c bbcry --top 25 --minv 0.1 -s log --in merged_metaphlan2.txt --out abundance_heatmap.pdf
metaphlan_hclust_heatmap.py -c bbcry --top 25 --minv 0.1 -s log --in merged_metaphlan2.txt --out abundance_heatmap.png

c设置颜色方案，top设置物种数量，minv最大相对丰度，s标准化方法，文件名结尾可先pdf/png/svg三种图片格式。更多说明详见 metaphlan_hclust_heatmap.py -h

按各样本丰度绘制热图，显示前25种高丰度菌种类，样品默认采用bray_curtis距离聚类，微生物采用相关性距离聚类；数值采用对数10进行变换

自定义数据库

基于bowtie2数据库重建标记序列

bowtie2-inspect ~/software/metaphlan2/databases/mpa_v20_m200 > markers.fa

追求你获得的maker至数据库

cat new_marker.fa >> markers.fa
bowtie2-build markers.fa ~/software/metaphlan2/databases/mpa_v21_m200

并在python命令行中添加相应的物种注释信息，详见 https://bitbucket.org/biobakery/metaphlan2/overview#markdown-header-customizing-the-database

株水平群体基因组

此步配合StrainPhlAn软件，分析宏基因样本中菌株水平序列变异，输入序列样本，输出MSA多序列比对文件。StrainPhlAn采用RAxML构建进化树。

可以生成如下结果：

以HMP6个样本为例，分析粪拟杆菌Bacteroides caccae序列在株水平的变异

有需要有朋友可按如下教程安装相关软件并分析 https://bitbucket.org/biobakery/metaphlan2/overview#markdown-header-metagenomic-strain-level-population-genomics

GraPhlAn图

需要安装好GraPhlan

# 基于丰度表生成graphlan文件
export2graphlan.py --skip_rows 1,2 -i merged_metaphlan2.txt --tree merged_abundance.tree.txt --annotation merged_abundance.annot.txt --most_abundant 100 --abundance_threshold 1 --least_biomarkers 10 --annotations 5,6 --external_annotations 7 --min_clade_size 1
# 绘图
graphlan_annotate.py --annot merged_abundance.annot.txt merged_abundance.tree.txt merged_abundance.xml
graphlan.py --dpi 300 merged_abundance.xml merged_abundance.png --external_legends

建议输出文件输出pdf，方便后期修改文字大小和内容

采用Graphlan展示物种组成

进一步学习

可参考metaphlan2官方教程

https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/metaphlan2

分析流程

参考文献

Duy Tin Truong, Eric Franzosa, Timothy L Tickle, Matthias Scholz, George Weingart, Edoardo Pasolli, Adrian Tett, Curtis Huttenhower, and Nicola Segata
MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling
Nature Methods 12, 902–903 (2015)

猜你喜欢

10000+：肠道细菌 人体上的生命 宝宝与猫狗 梅毒狂想曲 提DNA发Nature 实验分析谁对结果影响大  Cell微生物专刊

系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组  宏基因组

专业技能：生信宝典 学术图表 高分文章 不可或缺的人

一文读懂：宏基因组 寄生虫益处 进化树

必备技能：提问 搜索  Endnote

文献阅读 热心肠 SemanticScholar Geenmedical

扩增子分析：图表解读 分析流程 统计绘图

16S功能预测   PICRUSt  FAPROTAX  Bugbase Tax4Fun

在线工具：16S预测培养基 生信绘图

科研经验：云笔记  云协作 公众号

编程模板 Shell  R Perl

生物科普  生命大跃进  细胞暗战 人体奥秘

写在后面

为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外150+ PI，1500+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍末解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。

学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”

点击阅读原文，跳转最新文章目录阅读