饮食模式和社会心理因素是现代生活方式普遍存在的一部分，它们对肠道微生物群和人类健康有着至关重要的影响。然而，饮食和心理因素如何协调调节肠道微生物群对宿主的影响仍是未知的。中国药科大学郝海平团队和郑啸团队发现在应激期间，饮食中的罗伊氏乳杆菌将棉子糖代谢为果糖作为一个前馈环，有利于肠道干细胞(ISC)的更新和上皮稳态平衡。将饮食、精神压力和肠道干细胞连接起来，为研究改善精神压力引起的肠道损伤提供新思路。

作者以有肠道上皮功能障碍的慢性约束应激(RS)小鼠为研究模型，比较了多种成分的普通鼠粮(CD)和精制鼠粮(PD)下，心理应激对肠道微生物结构和上皮完整性的影响。结果表明，常规鼠粮显著降低应激引发的上皮损伤，其膳食中的棉子糖和罗伊氏乳杆菌能构成一种前馈环代谢，饮食-压力相互作用决定了微生物代谢下肠道干细胞的更新，可用于缓解肠道疾病。

文章简介

文章题目：A diet-microbial metabolism feedforward loop modulates intestinal stem cell renewal in the stressed gut

发表时间：2021

发表期刊：Nature Communications

影响因子：14.911

样品来源：小鼠粪便+肠道

研究手段：多样性+宏基因组+代谢组+QPCR

研究背景

肠道微生物群与宿主的健康和疾病有着密切的联系，此外，肠道微生物结构和社会心理输入(如社会压力)之间也存在着密切的联系。虽然这些联系还没有被完全了解，但有研究表明微生物菌群与生态位信号(如肠腔酸度、氧化还原电位和上皮能量学)动态相关，从而实现共生和适应宿主信号。虽然已知饮食模式和心理压力分别驱动肠道微生物的变化，但这些无处不在的生活方式因素如何协调重塑肠道生态系统尚不清楚，这是一个重要的知识鸿沟，因为肠道菌群可能是整合多种环境因素的中心枢纽，因此，在更广泛的背景下，有必要互连重塑因子以更好地了解宿主-微生物之间的相互作用。

胃肠道(GI)疾病，如炎症性肠病，已成为一个全球性健康问题，与现代社会的饮食结构和社会心理负担密不可分。迄今为止，大量的研究促进了对这些外在风险因素的理解，特别是对肠道微生物的不同影响。最近一项制定了40多种独特饮食的研究表明，肠道微生物密度可受到膳食营养素的扰动影响，其中蛋白质和纤维的浓度对黏膜炎症和结肠炎的发展的影响最大。但是，饮食和心理因素是如何重塑肠道菌群和影响肠道病理生理学方面，目前还没有答案。

研究思路

主要结果

1. 饮食模式决定了肠道上皮对慢性应激的脆弱性

小鼠的慢性约束应激展现了慢性应激暴露对肠道稳态的有害影响，目前还不清楚压力的影响是否可以通过饮食的变化来改善，为了分析饮食的潜在影响，在普通鼠粮和精制鼠粮两种饮食下连续14天进行慢性约束应激(每天4小时)。观察慢性约束应激小鼠肠道和结肠的形态学和组织学变化。与CD相比，PD喂养的小鼠应激小鼠中结肠缩短更明显(图1a, b)。

隐窝是干细胞的生态位，这些干细胞进行程序性增殖和分化，以维持上皮细胞的完整性和功能。应激后隐窝大小和绒毛长度的减少促使作者思考应激是否干扰了肠道干细胞（ISC）的增殖。正如预期，RS诱导回肠(Olfm4-positive)和结肠隐窝(Lgr5-positive)的干细胞密度显著损失(图1c, d)。与CD组相比，PD喂养的小鼠应激后回肠和远端结肠部分的干细胞损失更剧烈(图1c, d)。

作者推断，CD 和 PD 对应激诱导的 ISC 增殖和分化干扰的不同影响可能转化为对上皮损伤的不同易感性。为了验证这一点，在14天的慢性约束应激后，CD和PD小鼠在饮用水中连续7天接受2.0% DSS，以诱导肠道上皮细胞的炎症损伤(图1e)。在喂食PD的小鼠中，RS暴露14天后，结肠炎症状明显恶化，表现为结肠缩短(图1f)、炎症细胞因子增加(图1 g)。与此形成鲜明对比的是，CD组应激小鼠对DSS诱导的上皮损伤和炎症损伤要低得多(图1f, g)。

总体而言，这些数据表明，心理应激对肠道上皮细胞的恶化影响受到饮食调整的影响，这可能是由于干细胞维持的不同反应。

图1 慢性压力下肠道上皮细胞脆弱性对饮食依赖的差异

β多样性分析中，PCoA表明CD组和PD组之间的肠道微生物特征明显分离；LEfSe分析表明，在两种饲粮模式下，应激诱导了独特的细菌富集，CD组富集乳酸杆菌科，PD组富集放线菌科和瘤胃球菌科；随机森林分析显示，对准确性影响最大的微生物属为乳酸杆菌属(图2d)，在应激后CD喂养的小鼠中，该菌显著富集，但在PD下基本耗尽(图2e)。这些研究结果表明，饮食变化对应激诱导的肠道微生物重塑具有很强的影响，特别是乳酸菌丰度的变化。

图2 饮食与压力在重塑肠道菌群方面相互作用

3．普通饲料富含的乳酸菌在应激下维持上皮细胞更新

为了进一步了解应激诱导的肠道微生物变化和上皮反应之间的因果关系，作者将CD喂养的对照组和应激小鼠的粪便微生物移植(FMT)到无菌(GF)受体，并通过DSS诱导上皮损伤(图3a)。无菌小鼠移植应激小鼠粪便菌群(RS-GF/DSS)后，结肠炎表型包括DAI、结肠长度和隐窝密度有所减弱(图3b, c)，表明应激诱导的肠道微生物群变化对化学损伤具有保护作用。

为了深入了解乳酸菌在心理应激下的上皮稳态中的作用，结肠炎小鼠盲肠微生物群的16S rRNA基因测序证实了乳酸菌在受体小鼠中富集(图3d)。乳酸杆菌丰度的增加与应激后化学损伤的降低相关，之前也有报道称乳酸菌对肠上皮具有保护作用。

为了深入了解乳酸菌在心理压力下对上皮稳态的作用，作者对 CD 喂养的小鼠的粪便微生物组进行了宏基因组测序，观察到多种乳杆菌菌株，其中，罗伊氏乳杆菌在胁迫后丰度增加最为显著(图3e)。在 RS 期间，每日用罗伊氏乳杆菌 DSM 20016 对 PD 喂养的小鼠进行口服填喂，可有效地保护回肠和结肠中的Olfm4阳性干细胞(图3f, g)。体外培养时，罗伊氏乳杆菌处理的小鼠的肠隐窝显示出更高的自我扩展能力(图3h)。在这些应激小鼠中重新引入罗伊氏乳杆菌也可以明显改善结肠炎(图3i, j)。 这些发现表明CD富集的乳杆菌菌株在上皮对压力的反应中具有平衡作用。

图3 富含乳酸菌的饮食维持应激小鼠的上皮细胞更新

4．棉子糖是驱动肠道微生物和上皮细胞对压力反应的主要因素

为了确定导致不同肠道微生物反应的主要食物成分，作者对饲料进行了彻底的化学分析，尤其关注寡糖和多酚化合物。检测发现，CD和PD的16种差异成分属于低聚糖或多酚类(图4a)；棉子糖是一种天然存在于蔬菜中的膳食可溶性纤维，是CD中含量最高的成分，但在PD中很少发现(图4b)；为了了解棉子糖是否会影响应激的饮食型上皮反应，作者给小鼠喂食棉子糖补充的PD (RD)，并检测RS对肠道上皮完整性的影响(图4c)。与PD喂养的小鼠相比，RD喂养的小鼠应激后肠道(olfm4阳性)和结肠(Lgr5阳性)干细胞密度显著增加(图4d)。RD还增强了应激小鼠肠隐窝在体外形成类器官的能力(图4e)。

作者还发现补充棉子糖可以有效地降低应激过程中罗伊氏乳杆菌的损失(图4f)。为了检测棉子糖是否能直接促进乳酸菌的生长，作者检测了棉子糖处理后罗伊氏乳杆菌的生长速率，发现1 mM棉子糖对罗伊氏乳杆菌的生长具有明显的促进作用(图4g)，这可能解释了CD维持罗伊氏乳杆菌丰度的原因。

接下来，作者研究了膳食中添加棉子糖是否可以重现CD对上皮损伤的恢复能力，发现和PD组相比，RD组小鼠结肠缩短长度减少，上皮损伤、隐窝缺失和炎症紊乱程度降低(图4h, j)。这些发现表明，棉子糖的丰度似乎是驱动肠道微生物和上皮细胞对应激反应的主要因素。

图4 棉子糖是饮食依赖的上皮应激反应的基础

5．棉子糖产生的果糖促进小肠上皮细胞增殖

肠道微生物已经进化出了复杂的代谢各种膳食化学物质的能力，作为对环境刺激的适应性反应。宏基因组数据表明，胁迫后果寡糖(FOS)和棉子糖的利用发生了显著变化(图5a)。棉子糖通过细菌Msm转运系统转运，被糖苷酶水解为d-果糖和糖醛酸二糖(糖醛酸二糖依次降解为d-半乳糖和d -葡萄糖)。

作者观察到几乎所有参与棉子糖转运和水解的关键基因都在RS组显著富集(图5b,c)。作者还证实了，在PD中添加棉子糖时，应激小鼠肠道果糖显著增加，而葡萄糖似乎没有变化，半乳糖可以忽略(图5d)。为了明确棉子糖或其代谢产物是否能够维持ISC的功能，作者将分离的肠隐窝分别暴露于棉子糖或三种单糖中，发现葡萄糖和果糖(1 mM)对培养的类器官的生长和出芽有显著的促进作用，而棉子糖和半乳糖没有显著的影响(图5e)。

鉴于小鼠补充棉子糖后果糖增加，作者进一步探索果糖对应激小鼠肠道上皮细胞更新的影响。小鼠喂食PD，通过饮用水提供1%的果糖(图5f)，在应激小鼠中，果糖显著增加olfm4阳性ISC(图5g)，并且增强了离体肠隐窝向类器官的自我扩张能力(图5h)。这些发现揭示了棉子糖到果糖的细菌代谢可能在ISC功能适应应激损伤方面具有稳态作用。为了直接研究乳杆菌-棉子糖-果糖代谢轴对上皮细胞修复的调节作用，作者将经巴氏杀菌或活的罗伊氏乳杆菌接种到GF小鼠中，并在DSS暴露前对无菌老鼠进行CD喂养，结果表明活罗伊氏乳杆菌小鼠(CD-L. reuteri/DSS) 对肠道的化学损伤具有更强的恢复力(图5i)，作者还观察到，罗伊氏乳杆菌定殖导致肠道中棉子糖显著减少，结肠组织中果糖水平增加(图5m)，这表明在无菌小鼠中存在功能性代谢轴。

图5 棉子糖产生的果糖促进ISC增殖

6.  果糖参与糖酵解并促进小肠上皮细胞增殖

作者发现在肠隐窝培养过程中，果糖处理有效地增加了肠类器官中olfm4阳性干细胞的密度(图6a)。为了阐明增加果糖产量有利于ISC增殖的机制，作者对10 mM果糖处理的肠道类器官进行了24小时的非靶向代谢组学研究。如作者预期的那样，果糖补充后的代谢谱与对照组的代谢谱是分开聚集的。典型的代谢产物如乳酸和丙酮酸等在果糖处理后显著富集(图6b)；果糖诱导增强4个代谢途径，包括糖酵解途径和糖异生途径等(图6c)。

为了了解果糖的功能，作者进一步对暴露于果糖24小时后的肠道类器官中的U-[¹³C]-葡萄糖进行了同位素示踪分析，[¹³C]示踪显示，果糖处理的类器官中全标记乳酸(M+3)的百分比更高，说明果糖处理后糖酵解的增强(图6e)。总之，这些结果表明果糖在肠道类器官中诱导代谢重组，有利于糖酵解。

在代谢组分析中，作者还注意到在果糖处理的肝脏中会产生几种已知的代谢物，即果糖-1-磷酸(F1P)和二羟基丙酮磷酸(DHAP)(图6b)，虽然果糖代谢途径在肝脏和一些肿瘤中有很好的特征，但它在肠道类器官中的存在和作用还不清楚。作者证实了在肠道类器官中存在醛缩酶B，果糖处理后其mRNA表达增加了4倍以上(图6f)。因此，作者推断，果糖处理后肠道类器官中[¹³C]-葡萄糖的糖酵解率较高，可能与果糖向糖酵解底物的转化有关。

为了验证这一点，作者使用¹³C同位素示踪法确定了果糖在肠道类器官中的代谢命运，F1P在6个位置上都有部分¹³C标记(M+6)，证实了在肠道类器官中存在具有活性的果糖激酶(图6g)。在多个糖酵解中间体(G6P, F6P，丙酮酸)以及终端产物乳酸中也发现了¹³C掺入(图6g)。这些结果表明，果糖参与糖酵解并转化为参与肠道类器官中枢碳代谢的中间体(图6h)，这可能维持ISC的增殖。

图6 果糖代谢通过糖酵解促进ISC增殖

结果与讨论

研究通过普通鼠粮和精制鼠粮喂养应激小鼠，利用多样性、宏基因组和代谢组分析，确定了膳食中的棉子糖和乳酸菌之间的前馈环代谢，该循环在机制上与应激期间肠干细胞的更新和上皮细胞的修复有关。证明了棉子糖/果糖为基础的膳食可对抗心理应激对肠干细胞维持和胃肠道内稳态的有害影响。揭示了饮食-应激的相互作用，可用于缓解肠道疾病。

参考文献

Hou Y, Wei W, Guan X, et al. A diet-microbial metabolism feedforward loop modulates intestinal stem cell renewal in the stressed gut[J]. Nature communications, 2021, 12(1): 1-15.

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-20673-4

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