酶促反应动力学_酶促反应动力学实验
酶动力学综合实验
实验(一)——碱性磷酸酶
Km
值的测定
【目的要求】
1.
了解底物浓度对酶促反应速度的影响
2.
了解米氏方程、
Km
值的物理意义及双倒数作图求
Km
值的方法。
【实验原理】
1
、碱性磷酸酶：
碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、
骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性
磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。
2
、米氏方程：
Michaelis-Menten
在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，
导出了酶促反
应动力学的基本公式，即：
错误！未找到引用源。
(1)
式中：
v
表示酶促反应速度，
错误！未找到引用源。
表示酶促反应最大速度，
[S]
表示底物浓度，
错误！未找到引用源。
表示米氏常数。
3
、
错误！未找到引用源。
值的测定主要采用图解法，有以下四种：
①双曲线作图法(图
1-1
，
a
)
根据公式(
1
)
，以
v
对
[s]
作图，此时
1
/2
错误！未找到引用源。
时的底物浓度
[s]
值即为
Km
值，以克分子浓度(
M
)表示。这种方法实际上很少采用，因为在实
验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。
实测
错误！
未找到引用源。
一个近似值，
因而
1
/
2
错误！未找到引用源。
不精确。此外由于
v
对
[S]
的关系呈双曲线，实验
数据要求较多，且不易绘制。
②
Lineweaver- Burk
作图法双倒数作图法(图
1-1
，
b
)
实际工作中，常将米氏方程(式(
1
)
)作数学变换，使之成为直线形式，测定要
方便、
精确得多。
其中之一即取
(
1
)
式的倒数，
变换为
Lineweaver- Burk
方程式：
错误！未找到引用源。
(2)
以
错误！未找到引用源。
对
错误！未找到引用源。
作图，即为
y=ax+b
形式。此
时斜率为
错误！未找到引用源。
，纵截距为
错误！
未找到引用源。
。
把直线外推与
横轴相交，其截距相交，其截距即为—
错误！未找到引用源。
。
③
Hofstee
作图法(略)
把(
2
)式等号两边乘以
错误！未找到引用源。
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