四代 DNA 测序技术简述*
四代 DNA 测序技术简述
姚亭秀 （北京市第八十中学 北京 100102）
摘要
DNA 测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术，极大推动了生物学的发展。从 20世纪 70 年代至今，DNA 测序技术已历经4代。 简介被称为 DNA 测序始祖的第 1 代 测序技术、边合成边测序的第 2 代测序技术、不依赖于 PCR 扩增的第 3 代测序技术，以及处于 研发中的第 4 代测序技术。
关键词
第 1 代测序技术 第 2 代测序技术 第 3 代测序技术 第 4 代测序技术
中国图书分类号：Q81 文献标识码：A
自 1953 年 J. D. Watson 和 P. H. C. Crick 发现 DNA 双螺旋结构之后，DNA 测序技术随着科学技术的进步迅猛发展，目前已成为现代分子生物学研 究中最常用的技术之一。该技术从1977年起至今，历经了第 1 代至第 4 代的发展。 本文对一些主要测 序技术的原理，核心步骤及优、缺点进行简介。
1 第 1 代测序技术
第 1 代测序技术诞生于 1977 年,分别是 F. Sanger 和 A. R. Coulson 发明的 DNA 双脱氧核苷酸末 端终止测序法，以及 A. M. Maxam 和 W. Gilbert 发 明的化学降解法。在上述 2 种方法的基础上，后来又 分别诞生了荧光自动测序技术和杂交测序技术等。
1.1 DNA 双脱氧核苷酸末端终止测序法/Sanger 法
该技术原理为： 利用双脱氧核苷三磷酸（ddNTP） 比脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）少 3′－OH，因此不能 在 DNA 合成过程形成磷酸二酯键，使 DNA 合成反 应中断，进而测得 DNA 序列。 因该技术的主要发明 人为 F. Sanger，故该测序法又叫 Sanger 法。
该方法的核心步骤为：
1）将含有待测单链片段 的 PCR 反应液中分别加入一种含放射性标记的双 脱氧核苷三磷酸，完成 PCR 反应；
2）分别收 集、纯 化反应产物；
3）对 PCR 产物进行聚丙烯酰胺凝胶 电泳；
4）对电泳结果进行放射自显影，并判断待测 DNA 序列。 判断机理：每个 PCR 反应体系都含有 一种被放射性同位素标记的 ddNTP， 其会遵循碱 基互补配对原则与模板链的含氮碱基进行配对， 一旦其掺入新合成链的末端，该链就停止延长。因 此，每管反应体系中会合成以各自 ddNTP 为 3′端 的一系列长度不等的核酸片段。PCR 反应终止后， 对 4 管反应产物进行凝胶电泳， 会分离出长度不同的核酸片段，长度相邻的片段相差 1 个碱基，再 经放射自显影后，根 据 片 段 3′端的双脱氧核苷依 次读取碱基序列，从而获得 DNA 的碱基序列。 该测序技术优点为所测碱基序列长、 稳定性 好、可 靠 性 高；缺点是难以自动化，不 能 满 足 大 规 模测序的要求［1］ 。
1.2 化学降解法化学
降解法 由 A. M. Maxam 和 W. Gilbert 于 1977 年创建， 需对待测DNA分子进行化学降解。
该方法的核心步骤为：
1）利用 限制性核酸内切酶将 DNA 样品切断，回收大小介 于 10~200 bp 的片段，组建为测序文库；
2）利用碱 性磷酸化酶和多核苷酸磷酸激酶对待测 DNA 分 子的 5′P 进行放射性标记；
3）通过物理、化学等方 法将 待 测 DNA 片段 变 为 单 链；
4）对待 测 DNA 片 段的碱基进行不同修饰后，将上述样品分为 4 组， 利用能识别某一种或 某一类碱基的酶 （见 表 1 ） 对 DNA 分子进行切割，从而产生末端碱基特异但 长度不同的放射性标记 DNA 片段集群；
5）对 4 组 样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影，并 进一步判断待测 DNA 序列。
判断机理：
聚丙烯酰胺凝胶电泳可将长度只相差 1 个核苷酸的单链 DNA 分子 分 离 开，而 5 种不同的化学试剂可使目 的 DNA 分子上特异性的碱基体系断裂，由于断裂 后的 DNA 片段长度与其在原 DNA 分子 上 的 位 置 有关，所以反向于电泳顺序即为待测 DNA 碱基序列。
值得注意的是：如果 G＋A 中出现 1 条带，就看 G 列中是否有同样大小的条带 ， 若 有 即 为 G 碱 基，若无则为 A 碱基；
同理，如果 C＋T 中出现 1 条 带，就看 C 列中是否有同样大小的条带 ，若有 即 为 C 碱基，若无则为 T 碱基。
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