第一节原生质体分离

分离的程序：

材料选择：

二、原生质体的纯化

三、原生质体活力测定

影响原生质体数量和活力的因素

第二节原生质体培养

一、原生质体培养的研究进展

二、原生质体培养

管理：

影响因素：

第三节植物体细胞杂交技术

三、原生质体的融合类型

四、杂种细胞的选择系统

五、体细胞杂种植株的鉴定

思考题

原生质体指除去细胞壁之后裸漏具有生活力的原生质团。

特点：

具有全能性，全套遗传物质，具有细胞壁再生并能进行人工培养分化成完整植株。
吸收和分泌能力较高，易于摄入外源遗传物质、细胞器、细菌、病毒等；易于吸收氧、养分；细胞膜的透过性增强，利于细胞内产物的分泌。
一定条件下诱导细胞融合，形成杂种细胞。
稳定性差，失去细胞壁的保护，稳定性较差，易于受到渗透压等条件变化影响。

研究意义：

建立单细胞无性系：突变体筛选、刺激代谢产物生产、人工种子。
为细胞融合奠定基础。
遗传工程的受体材料。
原生质体是多种理论研究的实验系统。

PS：

原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。
PI染色：细胞核DNA染色。

几个概念：

原生质球：制备原生质体时，有残存的细胞壁，但仍是球形的细胞。
亚原生质体：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体，它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体（nuckearplast）：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
微小原生质体（miniprotoplast）：由于原生质体膜和薄层细胞质所包围的细胞核或部分染色体的小原生质体。含部分染色体的微小原生质体一般来源于细胞核正处于分裂过程的细胞。

第一节原生质体分离

分离方法：机械法、酶解法

机械法：将细胞放入高渗糖溶液中预处理，待细胞发生质壁分离后，原生质体收缩成球形后，借助利器（如刀等）或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。

机械法分离的特点：

原生质体产量低；
只能用于高度液泡化的贮藏组织，如萝卜的根、洋葱的鳞片、甜菜的根和黄瓜的中皮层等。难以从分生组织中分离得到原生质体；
可能适当地排除外加酶对原生质体的结构和代谢活性的有害因素。

酶解法：将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液作用下细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。

分离的程序：

材料选择
材料预处理
酶解
原生质体的纯化
原生质体活力检测

材料选择：

具有良好形态发生潜力；
量大、质地均匀；
经酶解后原生质体稳定性好、活性高

常用材料：

✓植物组织或器官：幼叶、胚轴、子叶；

✓无菌苗：茎、叶；

✓培养的细胞或组织：愈伤组织、胚状体和悬浮细胞

材料预处理目的：改变细胞和细胞壁的生理状态，提高酶解效率，增加细胞膜的强度，减少原生质体的损伤，使某些难于分裂的细胞进行分裂，提高原生质体的活力和分裂频率。

方法：

低温处理：龙胆试管苗叶片在4°C下处理后原生质体才能分裂。

暗处理：将豌豆枝条在暗中放置30h，叶片原生质体的活力提高，能持续分裂。

预培养：胚性愈伤核细胞悬浮系在新鲜培养基上培养5-7d再进行分离原生质体；叶片撕去下表皮，在愈伤诱导培养基上培养1周，可提高原生质体的分裂频率。

预质壁分离：将材料放到与酶液中糖浓度相同的糖溶液中预培养1h，使质壁分离，再进行酶解处理。叶片萎蔫处理：将叶片置于日光或灯光下2-8h使叶片萎蔫，有利于撕去下表皮。

酶解：植物细胞壁：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶。

常用

⚫果胶酶/离析酶
⚫纤维素酶
⚫半纤维素酶
⚫崩溃酶：分离培养细胞及根尖细胞。
⚫蜗牛酶分离花粉母细胞、四分体细胞
⚫胼胝质酶：花粉小孢子

渗透压状态：等渗或比细胞内渗透压略高，便于维持细胞正常渗透压。

作用：代替细胞壁对原生质体起到保护作用，使释放的原生质体保持活力和膜的稳定性。

糖醇类：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、半乳糖和木糖醇等等。

使用浓度：0.2～0.8mol/L，使原生质体处于一个等渗的环境中。

质膜稳定剂：CaCl2（0.7～1.0mol/L）、KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、MES（2-氮吗啉乙烷磺酸）和葡聚糖硫酸钾等。

EMS处理进行化学诱变。

酶液消毒处理：0.45μm的微孔滤膜过滤灭菌后备用

每种酶的最适PH是不同的，5~6之间。

酶浓度和酶解时间：

✓酶浓度：

果胶酶：一般为0.1％～1％
纤维素酶：一般为0.5～5％
蜗牛酶和胼胝质酶：一般为0.5～2.0％

✓酶解时间：30min～20h，一般<24小时。

✓温度：一般在25-28°C，兼顾原生质体及酶活性。

✓酶解过程：一般是在黑暗、静止条件下进行，或轻微振荡。

✓酶量：材料和酶量的比例一般为1g：10ml。

抽真空：让溶液渗入组织内部。

酶解法分离原生质体的特点：

（1）产量高，适用范围广，几乎可以从所有植物和它们的组织器官或细胞中分离出原生质体；
（2）酶解时，只需细胞质发生轻微的渗透收缩，不必发生质壁分离，对活细胞的损伤较轻；
（3）但原生质体可能会受到酶的某些不利影响。

酶解法分离原生质体是目前分离原生质体的最普遍和主要的方法。

酶解法分离原生质体的特点：

产量高，适用范围广，几乎可以从所有植物和它们的组织器官或细胞中分离出原生质体；
酶解时，只需细胞质发出轻微的渗透收缩，不必发生质壁分离，对活细胞的损伤较轻；
但原生质体会受到酶的某些不利影响。

二、原生质体的纯化

原生质体的纯化：漂浮法、沉淀法、界面法。

目的：一是把酶液冲洗掉，二是得到纯净的原生质体。

漂浮法：高渗溶液，比重大的溶液，原生质体漂浮在表面。对原生质体造成破坏。
沉淀法：原生质体的比重大于溶液时，将原生质体—酶混合液在低速下离心后，原生质体沉到管底。有其他杂质。
界面法：最好，两种不同密度的溶液，原生质体处于两种溶液的界面之间。

界面法选用分离系统：

PEG（6000）-Ficoll（40000）系统，
甘露醇（182.17 ）-Ficoll系统，
蔗糖（342.3 ）-甘露醇系统等。

分离过程

三、原生质体活力测定

原生质体活力=有活力原生质体/观察原生质体数*100%。

影响原生质体数量和活力的因素

❑植物材料的类型及生理状态

❑酶的种类、浓度、组合及酶解时间、酶解方式等

❑渗透压稳定剂

❑质膜稳定剂

❑温度、光照及pH

形态辩别：形态完整，富含细胞质，颜色新鲜，正常球形。

相差显微镜观察法：观察细胞质环流、核的正常与否。

荧光素双醋酸酯染色法（0.01%）：即FDA法，FDA能自由穿越完整细胞质膜，一旦进入原生质体后受酯酶裂解形成有极性的物质—荧光素，在紫外光照射下产生绿色荧光。

酚藏花红、伊凡蓝染色：死细胞。

第二节原生质体培养

一、原生质体培养的研究进展

二、原生质体培养

原生质体培养指在适宜条件下，使原生质体再生细胞壁，再进行细胞分裂分化，最终形成完整植株过程。

细胞壁再生：10h或更多，发生细胞壁再生。

细胞分裂：能持续分裂的细胞，经2～3周培养可形成细胞团。

PS：植板率：进行过细胞分裂而形成细胞团的原生质体的百分率。培养2～3周后统计。

愈伤组织形成：有再生壁的细胞如果各方面的条件满足将会持续进行细胞分裂，持续分裂的结果是形成细胞团－－愈伤组织

植株再生：可以通过两条途径完成植株再生过程：

❑诱导器官发生：愈伤－芽分化－根分化－完整植株

❑诱导形成胚状体：胚性细胞团/愈伤－胚状体－体胚的发育－完整植株

管理：

及时添加新鲜培养基；
逐步降低培养基的渗透压；
及时调整培养基中的激素成分。
不同培养方法，处理方式不同。

影响因素：

原生质体的活力；
原生质体的起始密度；
原生质体的营养与环境；
基因型。

第三节植物体细胞杂交技术

过程：膜融合——质融合——核融合。

杂种细胞：由不同来源的原生质体经诱导融合形成细胞。
细胞杂种：杂种细胞培养形成的杂种植株。
同核体：AA融合；
异核体：AB融合。
细胞质杂种：只含有亲本一方的细胞核，细胞质基因杂合或来源另一个亲本细胞杂种——完整植株。

三系法以细胞质雄性不育系为遗传工具，用到三种材料，即雄性不育系，雄性不育保持系和雄性不育恢复系。

胞质不育：

A. 伽马射线处理使核失活
B.罗丹明处理使胞质失活
C, D. 融合产物形成的克隆系
E. 植株再生
F. 成熟植株
G/H.杂种植株的不育花粉细胞
I. 可育花粉（充满淀粉粒）

体细胞杂交研究的意义：

突破物种间生殖隔离，创造新物种；
培养作物新品质和新品种；
细胞质杂种的获得；
细胞膜和细胞器行为的研究、细胞器的互作研究；
染色体行为的研究；

融合：

自发融合（spontaneous fusion）：去壁后的同种原生质体之间发生融合人形成同核体（homokaryon），频率一般在8~30%之间。它是由于不同细胞间胞间连丝的扩展和粘联造成的，不属于细胞杂交范畴。

诱导融合（induced fusion）：通过人工诱导的方式，使不同来源的原生质体之间发生融合，形成异核体（heterokaryon）

PEG诱导融合：

优点：

❑融合成本低，勿需特殊设备；

❑双核异核体形成频率高，重复性好；

❑不受物种限制，PEG诱导无物种特异性；

❑毒性低。

缺点：

❑融合过程繁琐；

❑一些植物种原生质体质膜性质强弱不一,常出现对 PEG敏感,而破碎的现象；

❑PEG的分子量大小、浓度高低的使用不当也可影响融合的效果。

电融合：穿孔通道，使质膜发生可逆性电击穿。

电融合的优点：✓不存在对原生质体的毒害问题；✓融合效率高，重复性好，融合率达60％以上；✓融合技术操作简便，对融合原生质体数易于控制等。

影响因素：原生质体融合无种属特异性，与外界条件有关。

❑原生质体质量、密度

❑融合方法

❑PEG的规格和纯度、作用时间

❑电融合参数

❑融合液：少量CaCl2，既可维持一定电导率，又对细胞有保护作用

电融合的优点：

不存在对原生质体的毒害问题；
融合效率高，重复性好，融合率到达60%以上；
融合技术操作简便，对融合原生质体易于控制等。

三、原生质体的融合类型

对称融合（symmetric fusion）、非对称融合（asymmetric fusion）：

对称融合：对两个完整的细胞原生质体融合，父母本均未处理。对后代贡献一样。

对称融合产生：对称杂交或不对称杂种。

非对称融合（asymmetric fusion）：一方亲本的全部原生质体与另一亲本的部分核物质及胞质物质重组，形成不对称杂种。

细胞选择：荧光标记、互补选择。

A组酸缺陷。B亮氨酸缺陷。A+B氨

四、杂种细胞的选择系统

意义：原生质体融合处理后，混合液中含有各种类型的细胞，异核体频率还不高，与同核体相比，融合后的异核体在培养基上分裂和分化并不占优势，还常由于启动分裂缓慢而受到同核体抑制，不能发育成杂种植株。因此，必须建立有效的选择体系，从各种类型的细胞中筛选出杂种细胞，使其在适宜的培养基和培养条件下生长、分裂、分化和再生。

1、细胞系互补选择法

2、物理特性差异选择法

3、生长特性差异选择法

细胞系互补选择法利用两个亲本具有不同的遗传和生理特性，在特定培养条件下，只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。✓激素自养型互补选择：对杂种细胞的选择是建立在细胞分裂、增殖所需激素自养的基础上的。

✓叶绿素缺失突变体互补选择：叶绿体缺失突变体与野生型互补来选择杂种细胞。杂种细胞具有正常的叶绿素，并能在特定的培养基上生长。选择培养基是适合白化细胞和杂种细胞增殖的培养基。

✓抗性突变体互补选择：杂种细胞对某种逆境具有抗性（为显性）的基础上选择。选择培养基是施加某种逆境条件的培养基

植株水平鉴定：形态，基因型，表型

细胞学鉴定：染色体核型分析、带型分析数目等。

五、体细胞杂种植株的鉴定

思考题

1. 原生质体、亚原生质体、核质体、胞质体的概念。

2. 原生质体培养的方法。

3. 为什么原生质体要培养在等渗培养基中？培养过程中如何管理？

4. 影响原生质体培养的主要因素有哪些？

5. 细胞融合有哪几类？

6. PEG融合与电融合的原理、特点是什么？

7. 原生质体融合的过程是什么？

8. 杂种细胞的选择方法。

9. 体细胞杂种的鉴定方法。

10. 什么是细胞质杂种？

11. 植物体细胞杂交技术应用的困难和局限性是什么？

细胞工程-6-原生质体分离核体细胞杂交相关推荐

生物制药重点知识汇总
现代生物技术包括(有时7个空,填七大工程:基因工程,细胞工程,酶工程,发酵工程,生化工程,蛋白质工程,抗体工程)(有时8个空,填七大工程+核心技术是基因工程). 为什么说生物技术的发展史实际上是生物制 ...
基因组组装的那些困扰，用单倍体基因组一一破解！
动植物基因组非常复杂,基因组大小.杂合度.GC含量.倍性等都会影响着基因组组装的难度和结果.特别是目前动植物基因组大多采用二倍体或多倍体材料直接进行测序组装,对于复杂基因组如高杂合.大基因组等,组装的 ...
文献解读 | 单细胞转录组图谱揭示了茶叶中儿茶素酯的发育轨迹和新的代谢途径
题目:Single-cell transcriptome atlas reveals developmental trajectories and a novel metabolic path ...
0613-prism-docs
https://docs.microsoft.com/en-us/previous-versions/msp-n-p/ff648465(v%3dpandp.10) 依赖注入使用Prism Libra ...
【强化记忆】生物选修三填空题考点强化记忆1-基因工程、细胞工程——2017年2月25日...
? 基因工程是按照人们的意愿,进行严格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品. ? 限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定 ...
MPB：林科院袁志林组-原生质体法制备根系腐生型共生菌(伞菌目)单核化菌丝...
为进一步提高<微生物组实验手册>稿件质量,本项目新增大众评审环节.文章在通过同行评审后,采用公众号推送方式分享全文,任何人均可在线提交修改意见.公众号格式显示略有问题,建议电脑端点击文末阅 ...
细胞工程-3-植物组织与细胞培养的基本原理
植物组织和细胞培养是指将植物的组织和细胞分离之后,在人工控制条件下进行培养,使其生长.增殖或再生成完整的植株的技术. 理论基础是植物细胞的全能性. 目录第一节植物细胞的全能性一.细胞全能性和细胞 ...
合肥工业大学—SQL Server数据库实验四：数据库的分离和附加
数据库的分离和附加 1. 数据库分离 2. 数据库附加 1. 数据库分离当SQL Server服务器运行时,该服务器上所有的数据库自动处于运行状态,而运行中的数据库文件是无法进行数据库文件的拷贝的. ...
前后端分离必备工具：Swagger快速搞定(整合SpringBoot详细教程)
本文根据狂神教学视屏同步所做笔记目录一.Swagger简介 1. 前后端分离 2. Swagger引入二.SpringBoot集成Swagger 1. 新建springboot项目 2. 导入S ...
分离内核和虚拟机支持安全的关键任务边缘计算
分离内核和虚拟机支持安全的关键任务边缘计算 Separation kernels and VMs enable secure mission critical edge computing Lynx软 ...

细胞工程-6-原生质体分离核体细胞杂交