标题：孤独症的基因变异与肠道微生物群、代谢物和细胞因子的改变有关

Gene variations in autism spectrum disorder are associated with alternation of gut microbiota, metabolites and cytokines

Gut Microbes [IF 7.667]

DOI: https://doi.org/10.1080/19490976.2020.1854967

第一作者：柳枝 毛旭华

通讯作者：刘星吟 教授 (xingyinliu@njmu.edu.cn)

主要单位：南京医科大学基础医学院；生殖医学国家重点实验室孤独症研究中心；江苏现代病原生物学重点实验室，江苏省人类功能基因组重点实验室；南京医科大学整合肠病学重点实验室；江苏大学附属宜兴人民医院。

关键词：孤独症谱系障碍（ASD）、肠道菌群、遗传变异、代谢组学、细胞因子

摘要

宿主遗传变异和肠道微生物群失调都与孤独症（ASD）有关。然而，就宿主遗传易感性而言，微生物群在孤独症病因中的作用尚不清楚。本研究旨在系统探讨孤独症儿童肠道菌群与宿主基因变异之间的相互作用。对26例ASD儿童和26例对照组进行全外显子测序，鉴定与ASD相关的单核苷酸变异位点。。我们的先前的研究表明，在这个队列中，ASD患者的肠道微生物群发生改变，代谢活动紊乱（Dan et al., Gut Microbes, 2020）。进一步进行系统的生物信息学分析，以确定SNV与肠道微生物群及其代谢物之间的关联。ASD单核苷酸多态性在先天免疫应答、蛋白糖基化过程和逆行轴突转运相关基因中显著富集。这些SNV还在微生物组组成和微生物代谢功能有关。此外，神经递质代谢网络中的大量代谢物被推断与特定的SNV和微生物存在因果关系。此外，我们的数据表明，宿主遗传和肠道微生物的相互作用可能在ASD的免疫和代谢稳态中起着关键作用。本研究为探讨ASD发病机制中宿主基因变异与肠道菌群的相互作用提供了有价值的线索。

导读

单卵双生子的孤独症共患率远远高于非单卵双生子，因此遗传因素被认为对ASD的发病有重要的作用。以前的大型队列研究已经揭示了一系列的多态性导致了不同程度的ASD患病风险。然而，据估计，在众多ASD病例中发现的新发突变、常见变异和短核苷酸多态性仅占病例的50%左右。

孤独症儿童已被证明患有一系列胃肠道（GI）症状，如气胀、腹泻和便秘，患病率从9%到91%不等。ASD与胃肠道症状普遍的相关性促使人们探索肠道微生物组在ASD发病机制中的作用，它是肠道生理、神经免疫和宿主行为的关键调节因子。越来越多的研究报告了孤独症患者肠道微生物群的失调。微生物群落通过其代谢物、细胞和分子成分影响人类生理，并为免疫系统的发育和功能提供关键信号。在ASD儿童中观察到代谢物和免疫紊乱。

研究表明，寄主遗传在塑造整个微生物组组成和单个细菌类群方面起着重要作用。例如位于NOD2基因的克罗恩病风险变异与肠杆菌科丰度的变化有关。此外，我们先前的研究发现，果蝇赖氨酸脱甲基酶5（KDM5）蛋白Jmjc结构域的遗传变异可导致肠道微生物群的组成变化，先天免疫途径的过度激活，5-HT水平异常，进而导致孤独症样行为。

然而，关于ASD中宿主遗传变异、肠道微生物代谢物和免疫系统的详细关联研究仍不清楚。在这项研究中，为了研究ASD中宿主基因组-微生物组相互作用的性质和程度，共对26例ASD便秘患者和26例正常发育儿童（TD）进行了外显子测序。通过与TDs的比较，以及ExAc1000基因组数据库和中国Millionome数据库（CMDB）中记录的去除次要等位基因频率（MAF）超过5%的SNV，确定了ASD中显著富集的SNV。然后对粪便微生物群、粪便代谢物和血清细胞因子进行测定，分析其与ASD SNV的关联。此外，还推测了宿主SNV与肠道菌群之间的因果关系（图1）。功能基因变异、肠道微生物群、代谢物和细胞因子的关联分析可以为揭示ASD疾病的发病机制提供新的线索。

图1. 分析流程图示。

结果

ASD SNV与肠道微生物群有关

使用匹配的TD队列和公共数据库作为对照，我们在ASD队列中共鉴定出567个外显子SNV。这些SNV与先前报道的孤独症知识库（AutismKB）中收集的ASD相关突变具有相同的突变模式（图2A）和突变特征（图2B）。我们发现功能性SNVs（蛋白质改变SNVs，包括非同义SNVs、stop gain SNVs和stop loss SNVs）的第一主成分与α多样性显著相关（图2C，R =0.45，P=0.020），表明宿主基因变异可能在形成这种多样性中起作用。另外我们观察到功能性SNV的第一主成分和微生物组第一主成分之间有轻微的显著相关性（图2C，R =0.37，P=0.059）。然而，当考虑到总富集SNV时，未检测到宿主遗传与微生物组多样性或组成之间的显著相关性。这些相关性表明功能性SNV与微生物组之间存在潜在的关系。

功能性SNV共定位到206个基因，其中70个基因为先前报道过的。例如，MUC4、SETD5和ANKRD11（图2E）。对这些基因的功能富集分析显示蛋白质糖基化过程、先天免疫反应和维甲酸代谢过程显著富集（图2F）。由MUC家族基因编码的粘蛋白是O-糖基化蛋白，在上皮表面形成保护性粘液屏障中发挥重要作用，粘蛋白被认为是对粘膜感染的先天性和适应性免疫反应的组成部分。越来越多的证据表明，糖基化胞外蛋白或参与糖基化的酶的变异可能与ASD的病因和发病机制有关。对先天性糖基化障碍（CDGs）小鼠模型和CDG患者行为表型的研究支持糖原基因变异导致或促进ASD的发展。维甲酸包括维生素A及其衍生物。维甲酸信号在调节大脑功能方面起着重要作用，包括神经元分化、神经突起生长、神经管前后轴的模式、神经递质释放等。在阿尔茨海默病的病理学中已经证实有缺陷的维甲酸信号，并且维生素A缺乏会加重孤独症儿童的症状。

图2. ASD儿童中富集的SNV。

SNVs与微生物种属相关

为了剖析特定SNV与微生物之间的关联，在校正年龄和性别的混杂因素后，使用标准线性回归法对每个功能SNV与每个物种丰度之间的关联进行了系统筛选。确定了46个候选关联（图3）。在这些结果中，糖基转移酶B3GALNT2的变异与ASD儿童中Catenibacterium mitsuokai的丰度增加有关。PGLYRP4的变异与Faecalibacterium prausnitzii有关。PGLYRP4是先天免疫系统的一部分，编码一种已知的抗菌蛋白，可识别细菌细胞壁的普遍成分肽聚糖。据报道，PGLYRP4的缺乏会导致肠道微生物群的变化。与免疫相关基因相关的其他关联包括CD180变异与Bacteroides dorei 和Clostridium sp. CAG:7的关联；RAET1G变异与两种拟杆菌属和Catenibacterium mitsuokai的关联，RTN4基因变异与Hungatella hathewayi的关联。CD180是一种TLR相关分子，主要在巨噬细胞、树突状细胞和B细胞上表达，它还可以感知细菌LPS来触发休眠的多发性骨髓瘤细胞的生长。在ASD患者中发现RAET1G和RTN4突变。RAET1G编码主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类蛋白家族的一员。它是自然杀伤组2成员D（NKG2D）受体的配体之一，在先天性和适应性免疫中作为激活受体发挥作用。RTN4是由核酸感应TLRs触发的免疫反应所必需的。此外，RTN4也是中枢神经系统轴突再生的抑制剂。

此外，载脂蛋白B（APOB）和RARRES2这两个参与维甲酸代谢过程的基因，分别与Lachnospiraceae bacterium 7_1_58FAA 和 Bacteroides eggerthii的丰度有关。APOB是抵抗细菌感染的天然屏障，在孤独症患者中观察到新发的APOB突变。据报道，Bacteroides eggerthii可增强小鼠的结肠炎。研究表明，拟杆菌属是与ASD儿童维生素A相关的关键微生物。其他关联包括硫胺转运蛋白SLC19A3和Clostridiales bacterium VE202-03等。在阿尔茨海默病中观察到硫胺素缺乏导致突触和神经回路缺陷。

图3. 与微生物相关的SNV。

先前对精神性疾病的研究表明，孤独症遗传风险可能部分通过表达数量性状位点（即eQTL）和表观遗传调控（如meQTL）发挥作用。因此，我们探讨了微生物丰度与eQTL或meQTL单核苷酸多态性的关系。在我们的ASD队列中有30个SNV被映射到精神性疾病的eQTL或meQTL图谱（图4A）。然而，只有少量的基因座与微生物有关（图4A）。非编码RNA LOC285819的外显子变异与Clostridium sp. L2-50有关，该外显子变异对结肠和脑组织中的BTN3A2具有eQTL效应。BTN3A2是免疫球蛋白超家族的成员，位于主要组织相容性1类基因座的端粒区。BTN3A2表达增加可能通过改变兴奋性突触功能而增加精神分裂症的风险。先前的研究报道了MHC基因变异对小鼠和人类肠道微生物组成的影响。这一观察结果表明，肠道微生物群的遗传调控可能是由宿主免疫系统介导的。此外，MRPS22（线粒体核糖体蛋白S22）的eQTL位点也与Roseburia faecis的丰度有关。据报道，MRPS22突变与线粒体疾病有关。

宿主SNV与微生物通路和基因丰度相关

为了评估宿主SNV如何以及在多大程度上影响微生物组的功能，我们检测了SNV与微生物生物学通过和基因之间的关联，并确定了13个宿主基因和20个微生物途径之间的22个关联（图4B）。一些变异与代谢途径相关，包括与脂质代谢途径相关的MUC3A和ANKRD20A2/3中的变异，以及与赖氨酸降解相关的LAMTOR1变异。值得注意的是，PLCG2和ALDH1A的变异与外源生物降解和代谢途径有关。ALDH1A1是一种具有脱氢酶、酯酶和抗氧化活性的多功能酶。此外，PLGG2的编码区变异与小胶质细胞介导的阿尔茨海默病先天免疫有关。有毒物质暴露已被流行病学证实是ASD的主要病因之一，而ASD患者的微生物组缺乏有毒物质降解途径。我们的研究结果暗示了遗传因素可能是微生物解毒不足背后的原因。此外，一些基因变异与免疫系统有关。例如，ASD相关基因SSH1的变异与人类免疫疾病有关。SSH1编码蛋白质去磷酸化并激活肌动蛋白结合/解聚因子cofilin。Cofilin是NOD1检测由细菌诱导肌动蛋白动力学变化所必须的，并且可进一步导致NF-κB活化和先天免疫应答。另外，NOXA，一种基于Nox2的NADPH氧化酶的激活剂，的变异与碳水化合物的消化和吸收通路相关；ANKRD42的变异与Wnt信号通路相关。

此外，在KEGG注释中，宿主SNVs相关基因在多种代谢途径中富集，包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅助因子代谢、核苷酸代谢和维生素以及其他次级代谢产物的生物合成。另外膜转运通路和细胞运动性相关功能上也观察到显著富集。

图4. QTL SNVs与微生物丰度间的关系（A），SNVs与微生物途径的关系。

SNV与微生物及其代谢产物的因果关系

微生物调节宿主生理的关键机制之一是通过其代谢产物。为了解释宿主SNV如何影响ASD中的微生物组及其代谢物，应用因果推断试验（CIT）来推断SNV、微生物及其代谢物之间的因果关系。针对与上一节中鉴定的与特定微生物相关的SNV，我们鉴定了8个SNV-微生物-代谢物的关系，包括之前检测到的4个SNV-微生物关联和8个代谢物（图5A）。

推测因果关系网络中的三种代谢物参与色氨酸和酪氨酸代谢，即酪氨酸亮氨酸、多巴醌和脱氨基酪氨酸。多巴醌的水平与PGLYRP4的变异和Faecalibacterium prausnitzii的丰度（图5B）间存在因果关系。此外，Faecalibacterium prausnitzii与2'-脱氧鸟苷水平相关，2'-脱氧鸟苷是叶酸生物合成途径中的代谢物。位于LILRA6的变异（rs56257556，c.A931G，p.N311D）与Bacteroides ovatus介导的去氨基酪氨酸、酪氨酸亮氨酸和丙氨酸代谢物3-（尿嘧啶-1-基）-L-丙氨酸有关（图5C）。LILRA6是一种白细胞免疫球蛋白样受体，在天然免疫系统和Ⅰ类MHC介导的抗原加工和递呈途径中发挥作用。先前在ASD中观察到LILRA6的新发突变。

图5. SNV、微生物和代谢物之间的因果关系

细胞因子与宿主遗传和微生物群的关系

研究表明免疫功能障碍是导致ASD神经发育缺陷的一个危险因素。于是我们测试了血清中七种细胞因子的水平。与先前的研究一致，ASD儿童的IL-1β、IL-4、IL-17α、IL-10和TGF-β水平显著高于TDs儿童（图6A）。一些研究表明，宿主基因可以通过异常的免疫激活重塑肠道微生物及其代谢产物。接下来，我们对基因变异和不同的细胞因子之间的关联进行了分析。所有五种差异表达的细胞因子水平均与至少一个SNV相关（图5B）。包括已知的ASD相关基因MUC2、MUC4、SETD5、MUC5B、INO80D、SEPT9、PGLYRP4、DST和CHD6等。此外，五种细胞因子IL-1β、IL-4、IL-17α、IL-10和TGF-β与微生物代谢物相关（图6C-D）。这些结果表明，肠道微生物代谢产物与宿主基因的相互作用可能在ASD患儿异常免疫激活中起重要作用。

图6. ASD中的细胞因子及其与基因、微生物和代谢物的关系

结论

在这项研究中，我们从宿主遗传、微生物组成、微生物功能、微生物代谢产物和宿主免疫等方面研究了ASD中宿主和肠道微生物之间的相互作用（图7）。为探讨当前孤独症与环境的相互作用机制提供了重要的研究线索。许多研究在ASD患者中观察到了肠道菌群紊乱、代谢活动紊乱和免疫功能障碍。然而，对于这些改变是否是病理状态改变的原因或结果知之甚少。因此，需要进一步的动物实验来确切地了解候选基因变异如何影响ASD患者的微生物群、代谢和免疫系统之间的相互作用。

图7. ASD宿主遗传、肠道微生物、粪便代谢物和细胞因子之间相互作用的总结。

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