拟南芥根微生物组的结构和组成

课题组介绍

这篇文章来自德国马普 Paul Schulze-Lefert 教授 研究组2012年发表的Nature。虽然文章己发表了7年，作为植物微生物组的开山之作，截止17年7月21日Google Scholar统计被引926次，推荐精读。而且即使是多年前的Nature，你会发现即使现在的你，重现一篇这样的研究，也是非常有难度的。
Paul是植物免疫和微生物组方面的大牛，每年都有CNS产出。详见其主页介绍。

现在Paul组的很多成员都成了教授，比如遗传发育所的沈前华和白洋研究员均曾经是Paul组的博士后。

摘要

背景：植物根系是多细胞真核生物与土壤接触的界面，而土壤是地球上最富集微生物的生态系统之一。众所周之，土壤细菌可以在根系内部繁殖，作为良性的内生菌调节植物生长和发育，以及增加作物产量和植物修复。内生菌的定殖与植物的初始免疫是明显矛盾的，因为植物细胞可以检测到一系列微生物相关的分子样式(MAMPs)并启动初始免疫终结微生物的繁殖。一些研究尝试去描述植物根系内生菌的结构组成，然而差异的取样方法和低分辨率的检测手段很难得出普遍性的规律。

结果：本研究介绍了土壤和根系微生物组的研究方法，比较根系与土壤微生物组的差别发现，活或死的细胞壁均可选择性定殖一些土壤微生物。研究发现拟南芥根系在不同土壤且相同条件下倾向于定殖变形菌门、拟杆菌门和放线菌门，且每个菌门主要来自于一个纲或科。土壤类型确定了根系定殖的细菌群体，基因型也对细菌群体有一定程度的影响。鉴定的土壤类型特异的细菌和根系定殖的细菌结果，支持根系内生菌来自土壤的结论。亮点发现，细胞壁样式的死细胞结构也可以定殖拟南芥根系富集40%的菌，且主要来自Beta变形菌门。因此，这些根系特异菌可能不是拟南芥特异的，只是在测试土壤中腐生细菌可以在任何植物根或残骸中发现。而拟南芥根定殖的放线菌依赖于代谢活跃的宿主细胞。

视频1. 植物微生物组根系取样方法how the roots of the soil grown plants were sampled

主要结果

图1. 根系细菌群体中的主要类型(土壤和根际土作为对照)

a. 绿弯菌门的平均相对丰度(千分比)，由于引物特异扩增该菌门，在下游分析中应去除此门。
b. 根系中丰度大于千分之五的的7大菌门，分别为变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、TM7(暂定名 Saccharibacteria，目前无法被培养)、厚壁菌门、浮霉菌门、酸杆菌门
c. 根系中前三大菌门中主要的科。从上到下分别为拟杆菌门中的黄杆菌科、放线菌门的链霉菌科，变形菌门又主要分别Alpha, Beta, Gamma三个纲；其中Alpha变形菌纲中的根瘤菌科、Beta变形菌纲中的丛毛单胞菌科和草酸杆菌科、Gamma变形菌纲中的假单胞菌科和黄单胞菌科。
图柱说明：图中空心柱为德国Golm土(沙土)，实心为科隆土(粘土)；*号代表两种土组间存在显著差异(P value < 0.05)，统计方法采用Benjamini-Hochberg提出的假阳性率校正的Pvalue值；

图2. 拟南芥根系定殖特异的细菌群体

a-g, 科隆土不同取样位置(compartment)特异的OTU(a-g)和以及与Golm土比较(e-g)。
a. 所有OTU的三元图，展示根、根际土和土壤中的比例关系，点越偏向那组，即在此组中相对比例较高。每个圆圈代表一个OTU，圆圈大小代表它的相对丰度(组间平均值)，位置由它在三组间的相对比例决定，图中网格线为20%的梯度坐标系辅助读取位置，深蓝圈标出根系显著富集的OTUs (FDR < 0.05)。
b. 同A类似，将根际土组替换为木材(牙签)，模拟死亡根系非活体的定殖过程。定义了根系特异的OTUs(深蓝色)、木材特异的OTUs(橙色)和根系和木材共同富集的OTUs(浅蓝色)。
c. 热图展示b图中高亮各组OTU的相对丰度，行名称为b图中定义的三组(根、木材、共有OTU)，列为样品按共丰度聚类分为不同取样部分的三大组。
d. b图中定义的三类OTUs的主在门水平分类结果比例，明显看到根中特异的为放线菌门，而共有和木材特有的均主要为变形菌门。
e. 两种土壤类型比较根中共有或特有OTU的数量。
f. 珊瑚状放线菌属在不同取样位置和土壤中相对丰度。
g. 珊瑚状放线菌属在不同土壤和季节下不同拟南芥生态型中的相对丰度。星号代表组间有显著差异(FDR < 0.05)

图3. 拟南芥根表可检测定殖的细菌。

a-e. 细菌结构的扫描电镜图片；图中标尺大小为1微米。
f-j. CARD-FISH检测细菌，绿色为AlexaFluor488荧光素，成像采用confocal激光扫描显微镜，图中标尺大小为20微米。
f. 真细菌检测使用EUB388探针;
g. 负对照采用EUB388探针反向互补序列;
h. Beta变形菌门检测采用BET42a探针;
i. 拟杆菌门检测采用CF319a探针；
j. 放线菌门检测采用HGC69a探针。

图4. 自然生长的植物拟芥根系选择定殖土传细菌

a. 所有样品按bray-curtis距离进行聚类，可以看到明显分为三组，即木材、根、土壤和根际土；各样品颜色代表土壤来源、形状代表取样部分；样品标准化采用抽样至1000条序列并筛选丰度大于千分之五的OTU。
b. 定义的各类OTU在自然样品和温室样品间下比较共有的比例；
c. 三元图展示OTUs的相对丰度和比例贡献，高亮标出了定义的根特异富集的OTUs和与木材共有特异富集的lOTUs。
d. 珊瑚状放线菌属在自然样品中的丰度。

经验总结

1. 文中提出了植物根、根际土的实验方法，值得学习；

2. 实验设计了木材为对照，去除腐生菌，非常聪明；

3. 图表组合非常漂亮，即使在现在也是Nature级别的标准；

4. 实验设计组非常多，有不同地区、不同季节、不同取样部分，还有温室和自然环境。需要有很大的全局关，才能把故事讲好。

5. 写作非常好，故事说的逻辑清楚，学习写作模板。

实验方法

我们种植拟南芥生态型Shakdara(Sha)和Landsberg erecta(Ler)在科隆土(粘土淤泥富集)和Golm土(沙土富集)，并在温室中可控的生长环境和确定的种植密度。

Reference

1. Paul Schulze-Lefert组主页 http://www.mpipz.mpg.de/schulze-lefert

2. Bulgarelli, D., et al. (2012). “Revealing structure and assembly cues for Arabidopsis root-inhabiting bacterial microbiota.” Nature 488(7409): 91-95. http://www.nature.com/nature/journal/v488/n7409/abs/nature11336.html

3. 白洋组主页 http://bailab.genetics.ac.cn/ 公众号：植物微生物组

4. 沈前华组简介 http://sourcedb.genetics.cas.cn/zw/zjrck/200907/t20090721_2130972.html

5. TM7菌门 https://en.wikipedia.org/wiki/Candidate_division_TM7

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