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经常有做临床研究的朋友问分子机制怎么做，今天正好与梦熊聊到这个话题，所以小张就简单谈一下对这个问题的理解。

个人认为，分子机制的研究总体来说分为5个层次：

1. 层次一：相关性；一般对应的文章分数在1-3分左右；

2. 层次二：因果关系；一般对应的文章分数在3-5分左右；

3. 层次三：直接作用；一般对应的文章分数在5-10分左右；

4. 层次四：嵌套组合；一般对应的文章分数在10-20分左右；

5. 层次五：观念创新；文章的层次是CNS级别。

下面我们展开说一下：

层次一：相关性

两个因素的相关性是我们做机制研究的第一层关系，也是最弱的关系。这里的因素可以是药物、基因、现象等等，比如基因A的表达水平与肝癌肿瘤病人的预后、药物的浓度与细胞凋亡的比率等等。对于疾病的研究来说，如果某因素与疾病进展或者预后有强相关性，我们就可能把该因素作为疾病进展或者预后的marker，比如甲胎蛋白AFP之于肝癌，所以有一类研究我们称之为伪基础研究，研究的名字比如：Prognostic Significance of gene A expression in B disease. 或者Association between gene A and B disease.

需要说明的是相关性是最弱的逻辑联系，因为两个因素之间存在相关性有可能是完全没有逻辑的，比如北京的房价与肺癌的发病率之间的相关性。

（策略篇）S4E25：从外泌体研究看biomarker类课题设计

层次二：因果关系

在相关性的基础上深入的一层关系是因果关系，即因果关系是相关性的子集。如果A基因表达或者突变与B疾病之间存在相关性，那么我们有可能把A因素作为B疾病的biomarker；如果A基因是B疾病的原因，那么我们可以通过干预A基因影响B疾病进展。这点相信大家都知道。

1）在分子机制研究中，因果关系的存在是我们要证明的第一步，比如在进行某中药通过AMPK信号通路抑制细胞增殖的研究中，为了说明某中药调控AMPK信号通路，我们最常规的手段就是通过WB检测AMPK信号通路以及下游分子的表达或者活化状态，就是证明中药Z剂量与AMPK通路分子表达的因果关系。

2）为了证明因果关系的第二个部分就是大家常说的挽救实验，即如果上调A因素导致了B结果的出现，对A因素的下调是否可以逆转B结果的出现。

层次三：直接作用

承接第二个层次，如果A因素是导致B结果出现的原因，那么A因素是直接原因呢还是间接原因？对应到分子机制研究中就是这样：A基因的上调导致了B蛋白的磷酸化，那么A基因直接与B相互作用介导的（直接作用）还是通过C介导的呢？

1）所以为了证明这一点，我们通常用分子间的直接作用来验证，比如蛋白与蛋白作用的co-IP，GSTPulldown，蛋白与RNA作用的RIP、RNApulldown，蛋白与DNA作用的CHIP、EMSA等等，就是为了判断两者之间的直接还是间接作用。

2）当然，在以分子为单位的研究中，第二部分就是“分子局部”研究，比如已经证明了蛋白A与RNA B是直接结合的，“分子局部”研究就是确定蛋白A的什么局部（哪些氨基酸形成的结构域）与RNA B的哪段序列直接结合。

做到这一步，绝大多数分子研究的深度就够了，即使是最顶级CNS级别的文章要求也不过如此。

层次四：嵌套组合

既然第三层次分子机制的研究深度已经够CNS级别的文章了，第四层次就不仅仅是研究深度的问题了，而是故事的丰富度，在和中我们说的一个观点就是从第三层次到第四层次的升级：单线到多线的过渡，即把几个第三层次的单线研究嵌套组合为一个故事，第三层次要求把一个故事的一条线讲清楚，第四层次要求把一个故事的多条线讲清楚，而多条故事线的汇总形式有很多：比如双头蛇模式、反馈回路模式等等。

比如在第三层次的研究中，我们已经通过各种实验证明了lncRNAA通过抑制蛋白B的降解上调B的表达，在第四层次中双头蛇模式是：lncRNAA 除了通过抑制蛋白B的降解上调B的表达（层次三），还可以通过ceRNA的方式下调microRNAC表达从而促进B的表达；反馈回路模式则是：lncRNAA除了通过抑制蛋白B的降解上调B的表达（层次三），而上调表达的蛋白B促进了lncRNAXXX的转录，从而形成正反馈回路。

层次五：观念创新

层次五就是最高层次了，即观念层面的创新，一般到这个层次就是CNS级别了，比如新现象的发现、两个貌似没有关系的现象之间联系的揭示等，这点大家看CNS的文章应该有感触，举个例子：外泌体的形成与细胞自噬之间有没有关系呢？

最后用一张图来总结：