土壤氮素短缺是限制作物生产的主要因素，每年农业消耗的肥料中约有60%是氮肥，增加氮肥施用提高了产量但带来了污染和资源浪费。从全基因组水平上解析作物氮高效的遗传及分子机制，培育氮高效作物新品种，提高作物的氮素利用效率，是解决我国与世界农业的面源污染、实现农业可持续发展和保护环境的关键。氮素利用效率（NUE）涉及氮的吸收、运输、同化、储存和再利用等过程，由许多基因控制，对小麦的高氮利用率的作用机制没有得到很好的解释。

2022年，中国科学院大学遗传发育所发表于《Molecular Plant》（IF=21.949）的“Comparative genomic and transcriptomic analyses uncover the molecular basis ofhigh nitrogen use efficiency in the wheat cultivar Kenong 9204”文章，通过比较转录组和比较基因组的研究为阐明小麦NUE提供了机会。

一、实验设计

本研究组装了小麦KN9204基因组，系统地鉴定了与氮吸收和代谢相关的基因，并在全基因组水平上表征了KN9204的NUE机制，利用基因组、转录组、表观组及重要基因功能揭示了驱动高氮利用率（KN9204）与低氮利用率（J411）两个小麦品种之间NUE差异的分子机制。

图 实验设计

二、实验结果

1、小麦KN9204基因组组装，注释和分析

为了研究小麦NUE的分子机制，使用二代测序、PacBio测序和Hi-C分析的组合策略对小麦KN9204的基因组进行测序和组装。组装的小麦基因组大小为14.77 Gb，scaffold N50是21.87Mb。通过Hi-C分析，将14.24Gb组装序列分配给21条染色体。对低NUE品种J411的基因组进行了40x重测序，通过比对KN9204基因组检测到存在/缺失变异和拷贝数变异，并在J411中鉴定了34,564个基因缺失，长度范围从25bp到56kb；鉴定了2546个重复序列，长度范围从138bp到262kb。

通过对小麦KN9204基因组注释，研究确定了3,821,926个转座因子（TE，图1D），两个LTR逆转录转座子超家族，即RLG（Gypsy）和RLC（Copia），以及一个DNA转座子超级家族DTC（CACTA），约占TE总拷贝数的75%，占TE总序列长度的90%以上。预测了总共110,326个高置信基因，根据基因序列及注释信息，将882个基因注释为氮代谢基因（NMGs）。NMG包含各种基因家族，包括硝酸盐转运蛋白（NPF、NRT2、NAR2、CLC、SLAH）、硝酸还原酶（NIA、NIR）、铵转运蛋白（AMT）、铵同化蛋白（GS、GOGAT、GDH、ASN、AspAT）、氨基酸转运蛋白（APC）和与氮代谢相关的转录因子（TF）。NMGs主要位于染色体的长短臂的两端，每条染色体上有28-55个NMG。

Hi-C结果分析表明，小麦KN9204染色体形成了与大麦和玉米相似的三维U型结构，即典型的“Rabl”构型，并对21条染色体的compartment进行了深入分析（图1C）。

图1 高NUE小麦品种KN9204的大田表型及基因组组装和注释

2、小麦KN9204与中国春和其他禾本科植物的比较基因组分析

KN9204与中国春（CS）的同源三倍体有87717个高置信度基因，位于三个亚基因组中的分布比例为1:1:1，其中34%是位于同源染色体上的共线性基因，这一比例显著低于中国春相关数据。通过比较KN9204和CS，其DNA序列沿21条染色体高度共线，包括着丝粒区域，但1BS区域除外，该区域起源于黑麦的1RS。在55个倒位中，只有7个发生在D基因组，进一步说明了亚基因组D的染色体结构最稳定。

在KN9204 1BS上预测的1008个高置信度基因中，486和308个基因分别与CS高度和中度同源。而KN9204 1BS的214个基因在CS 1BS上没有同源性，差异主要包括43个密码子移位的基因、71个密码子终止插入的基因。

除了CS之外，还将KN9204基因组与其他八种禾本科植物（野生二粒小麦、乌拉尔图小麦、山羊草、大麦、短柄草、水稻、玉米、高粱基因组）进行了比较，找到了218个小麦特异性基因家族中的硝酸盐外流转运体（NAXT）基因，野生二粒小麦（BBAA）中存在所有六种NAXT，在小麦进化过程中通过自然选择得到了很好的保存。这一发现表明，7BS易位后4AL上的NAXT重复可能通过增加小麦从根到地上部的氮运输能力，在小麦对土壤不同氮水平的适应性中发挥作用。

3、小麦KN9204高亲和硝酸转运蛋白基因家族（NRT2s）的扩张和功能分化

高亲和硝酸转运（NRT2）基因家族在低氮条件下的上调表达可提高氮素的有效吸收，对维持品种耐低氮胁迫至关重要。二倍体小麦中NRT2基因家族的大小大约是普通小麦中的九倍，表明NRT2基因在小麦进化中发生了大规模扩张，扩张发生在小麦族进化时期。通过构建NRT2基因家族在高等植物的进化树，以阐明NRT2基因家族在植物中的扩张事件及重要时间节点（图2A）。从五个基因组中收集的NRT2基因的拷贝数表明了NRT2基因家族在基因组从双子叶-单子叶植物分化到小麦-大麦分化过程中的进化途径。形成了两个串联重复的基因簇，第一簇中的六个基因高度表达，而第二簇中的七个基因在高氮（HN）和低氮（LN）条件下水培生长的KN9204根中的表达非常低（图2B）。

使用qPCR分析了NRT2基因在低氮及盐胁迫下的表达特征，发现后期扩增的NRT2基因对低氮及盐胁迫相应不同，发生了功能分化（图2C）。NRT2基因家族在扩张过程中的功能分化可能与小麦族对低氮胁迫及其他非生物胁迫的适应性增强有关。

利用ATAC-seq技术，评估了染色质可及性并确定44个NRT2基因的近端启动子区域中的富集顺式基序，并比较了高低氮条件下20个低氮敏感响应NRT2及24个低氮不敏感响应NRT2转录起始位点开放性的差异。发现20个低氮敏感响应NRT2转录起始位点的开放性在低氮条件下显著提高，而低氮不敏感响应NRT2转录起始位点的开放性在低氮胁迫下没有发生变化，证明不同氮环境可通过影响NRT2转录起始位点的开放性进而调控NRT2基因的转录表达（图2D）。同时还对低氮敏感响应的NRT2的顺式作用元件和反式作用因子进行了分析，发现G2-like转录因子 和 Nin-like (NLP) 转录因子参与了NRT2的低氮诱导表达。

图2  NRT2基因家族的扩张和NRT2基因复制的差异转录调控

4、小麦生殖生长高表达基因的时空共表达网络

与KN9204相比，低NUE品种J411对氮限制更敏感（图1A），每穗粒数显著减少（图1B）。为了研究氮状况如何影响两个不同NUE品种的基因表达，对拔节期、孕穗期和抽穗期以及开花后7、14、21和28天的种子进行了转录组分析。WGCNA分析显示，KN9204组织和发育阶段特异性高表达（TDHE）基因数目在高、低氮条件下无明显差异，而J411的TDHE基因数目在高低氮条件下存在较大变化（图3A）。GO富集分析表明，在穗发育过程中，KN9204和J411中的TDHE基因主要在“细胞分裂”和“光合作用”富集。在种子发育过程中，7-DAA和14-DAA种子中的TDHE基因分别富集在“氮同化”和“碳代谢”（图3A）。鉴定了11种TF和四种氨基酸/多胺/有机阳离子（APC）转运体，它们与WGCNA网络中最高表达的编码谷氨酰胺合成酶GS1（TaKNGS-4B2）密切相关。

在田间试验中，分别研究了HN（高氮）和LN（不供氮）处理的单株穗数（SNPP）和每穗粒数（GNPS）。KN9204在HN条件下的SNPP显著低于J411，但KN9204中的GNP在HN和LN条件之间的差异要小得多，田间试验结果表明，KN9204对LN的耐受性明显高于J411。

在LN条件下，组蛋白基因在J411幼穗中的表达受到显著抑制，但在KN9204幼穗中没有（图3Bb），与HN条件相比在LN情况下的共表达连接性在J411中显著降低（图3C）。在21-DAA和28-DAA种子中，HN和LN处理之间的TDHE基因也存在较大差异。在KN9204和J411之间的种子成熟过程中，低氮诱导的基因表达具有时间变化。在LN条件下，J411的14-DAA，21-DAA中60%的KN9204特异性时空高表达基因的表达上调，21-DAA种子中约20%的J411特异性时空高表达基因在KN9204的28-DAA基因中表达上调。在HN条件下，未观察到KN9204和J411之间表达上调的时间变化。功能富集分析显示，这些表达高峰前移的基因在籽粒灌浆过程中细胞壁的形成和重构中发挥重要作用。

图3 组织和发育阶段特异性高表达（TDHE）基因以及缺氮对高NUE品种KN9204和低NUE品种J411的生殖生长的不同影响

5、小麦KN9204和J411之间氮代谢基因（NMGs）的全基因组和转录差异

为了了解驱动KN9204高NUE的分子机制，在全基因组和转录水平上比较了KN9204和J411的NMG。在基因组水平上，除了2B上的一个NPF基因外，所有KN9204 NMG的等位基因都存在于J411基因组中，18.1%的NMG在KN9204和J411之间的编码序列中显示出变异，单标记数量性状位点（QTL）分析表明，大多数变异对氮代谢和产量形成有影响。

在转录水平上，在KN9204和J411的根中分别特异表达了130和99个NMG，超过60%的根表达的NMG对氮限制有反应，KN9204和J411之间的转录谱比较表明，根中NMG数量最多，这些结果表明，根和种子是对环境氮状况最敏感的两个器官。

比较了硝酸盐转运蛋白基因在有氮和无氮水培7、14、21和28天的KN9204和J411根中的表达谱。随着LN处理时间的延长，KN9204中具有较高表达水平的NRT2和NPF基因的比例逐渐下降，因为J411中大多数硝酸盐转运蛋白基因的上调表达水平高于KN9204，尤其是NRT2/NAR2家族中的基因（图4A，B）。这一结果表明，J411比KN9204对氮限制胁迫更敏感。

通过系统发育分析和基于同源性的功能预测，将不同表达的NPF基因分为三个功能类别：“氮感应和吸收”、“硝酸盐/肽吸收”和“根-地运输”（图4C）。在幼苗根系的四个生殖阶段中，HN和LN条件下，“硝酸盐/肽吸收”“根-芽运输”“氮感应和吸收”的相关基因在KN9204中高表达；LN条件下，J411中与“硝酸盐感应和吸收”相关的NPF基因的高表达，也表明了J411比KN9204对环境氮缺乏的反应更强。除根系外，氮供应的变化也对KN9204和J411种子中NMG的表达谱有不同的影响，尤其是NPF基因。

图4 高氮和低氮条件下小麦KN9204和J411根中NRT2和NPF基因的表达

三、研究结论

本研究组装了高NUE小麦品种KN9204的高质量基因组，提供了普通小麦的全面氮代谢基因图谱。综合比较转录组、比较基因组学和氮素积累等生理学数据，显示在生殖发育阶段KN9204比J411具有更高的氮利用效率；发达强壮的根系，以及根系形态建成和营养吸收相关基因的高表达支持KN9204比J411具有更强的氮吸收效率。由此表明，KN9204的高NUE是一种在基因组、转录和转录后水平以及根系等多个水平上控制的综合效应。该研究中获得的数据为理解小麦氮高效的分子机制提供了新的观点，为培育氮高效的小麦新品种提供了有价值的基因组资源。

图5 小麦KN9204氮高效的遗传及分子调控模型

参考文献

Comparative genomic and transcriptomic analyses uncover the molecular basis of high nitrogen use efficiency in the wheat cultivar Kenong 9204. Molecular Plant, 2022.

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