编者按

2020年10月22日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿团队在Nature Communications在线发表了题为Carotenoids modulate kernel texture in maize by influencing amyloplast envelope integrity的研究论文。玉米籽粒颜色和硬度在育种过程中一直受到人工选择，然而这两个性状的内在联系及分子机制却不被人了解。该团队通过巧妙遗传设计，深入解析了类胡萝卜素成分改变影响玉米硬质胚乳形成的分子遗传机制，为培育高β-胡萝卜素、硬质的优良品种奠定基础。鉴于该研究的意义，我们有幸邀请到巫永睿团队对该研究进行了详细地介绍，并邀请他们分享了该研究背后的故事，以飨读者！

研究解读

玉米籽粒质地(kernel texture)是一个非常重要的农艺性状，它由硬质胚乳和粉质胚乳的比例所决定：硬质胚乳部分越多，籽粒硬度越高，玉米在机械收获、运输和储存过程中就能抵抗更强的机械压力而保持籽粒完整性；同时硬质胚乳也有助于防止籽粒发生霉变。玉米硬质胚乳多少还直接影响食品加工，硬质胚乳是玉米糁(corn grit)及玉米片(cornflake)的主要来源；爆裂玉米能否爆裂必须依赖硬质胚乳。野生玉米(teosinte)籽粒虽然有坚硬的颖壳保护，但硬质胚乳含量很高，暗示硬质胚乳可能在进化上受到了选择。野生玉米被鸟类啄食后，硬质胚乳能增加籽粒在通过动物消化道不被破坏的几率，从而有利于种子传播。在自然群体中，玉米籽粒质地变异程度很大，从完全粉质到完全硬质的种质资源都有。玉米硬质胚乳是如何形成的呢？玉米胚乳主要储藏蛋白是醇溶蛋白，它们储存在来源于粗糙内质网的蛋白体(protein bodies, PBs)中；而淀粉的合成和储存都在淀粉体(amyloplast)中，形成淀粉粒(starch granules)，外面包围着磷脂双层膜。蛋白体成熟时直径为1-2 μm，远小于淀粉颗粒的大小(20-30 μm)。胚乳在发育过程中，胚乳外周区域蛋白体密集，淀粉粒小，而中央区域蛋白体稀疏，淀粉颗粒大。早在60年前，美国先锋公司的Donald Duvick博士在光学显微镜下观察了胚乳灌浆期硬质区域形成的细胞学特点，他形象地把胚乳细胞比喻成一个充满大理石(淀粉粒)和铅弹(蛋白体)的盒子，而粘稠的细胞质则比喻成透明的胶水。当种子成熟脱水时，胚乳外周区域细胞内的所有膜系统破裂，大量醇溶蛋白和细胞其它所有内含物(细胞质、细胞器和细胞骨架等)交织在一起形成蛋白基质(proteinaceous matrix)，紧紧包裹住淀粉粒，形成致密的硬质胚乳，就像混凝土一样；而胚乳中央区域由于缺乏蛋白体，淀粉粒完全裸露，形成疏松的粉/软质胚乳。根据这个模型，影响醇溶蛋白合成，蛋白体形成以及淀粉合成的突变体就会导致籽粒硬粉质改变。目前，已报道的一系列单基因粉质突变体(opaque,  floury)主要揭示了醇溶蛋白/蛋白体、淀粉/淀粉体以及细胞骨架相关蛋白在硬质胚乳形成中的关键作用，而这个过程中蛋白体和淀粉体如何互作，受到哪些代谢产物影响却不清楚。

遗传材料创制 (左一王海海副研究员，中间巫永睿研究员，右一黄永财博士后)

W64A和A619是玉米遗传学研究最常用的两个自交系，分别代表了正常硬质和粉质表型两类材料。巫永睿研究组利用W64A和A619构建近等基因系(NIL)群体，两个亲本相互杂交产生的F₁后代都是硬质表型，说明粉质相对于硬质是隐性表型，控制基因命名为vitreous endosperm 1(Ven1)。 通过连续回交将Ven1^W64A导入A619，我们发现F₁BC₁和F₁BC₂都没有出现硬粉质表型分离，在F₁BC₃时后代籽粒有硬质、粉质和中间型分离；在F₁BC₅时，后代籽粒出现1：1的硬粉质分离，说明Ven1^A619的外显率受到遗传背景的强烈影响。利用A619作为轮回亲本与另外两个正常硬质材料(D1051和P25)构建了回交群体也发现了前两次回交世代表型不分离的现象。利用BSA测序技术并结合传统精细定位，我们克隆到Ven1，发现其编码β-胡萝卜素羟化酶3(β-carotene hydroxylase 3, HYD3)，它通过羟化非极性的α-/β-胡萝卜素的β-紫罗兰酮环，产生极性的叶黄素(lutein)和玉米黄质(zeaxanthin, 3,3’-二羟基-β-胡萝卜素)。Vallabhaneni (Plant Physiol., 2009)及Yan (Nature Genetics, 2010)等人报道Hyd3的突变可以有效提高β-胡萝卜素的含量，而Ven1^A619正是这样一个优良等位变异。Ven1^A619 基因的 3^’端含有一段1250-bp的缺失，近似于一个功能缺失突变体(这个截短蛋白Western检测不到)。我们构建了Ven1的RNAi转基因(KN5585自交系背景)，发现沉默该基因表达能导致完全粉质胚乳表型。当Ven1RNAi导入NILW64A时，阳性籽粒均为粉质表型。硬/粉质主效QTLVen1的克隆Ven1基因在淀粉胚乳中高表达，蛋白定位在淀粉体膜内侧，与类胡萝卜素合成位置一致。NILA619和NILW64A的胚乳总类胡萝素含量没有差异，但前者的非极性类胡萝卜素明显高于后者，而极性类胡萝卜素水平则相反(近等基因系都是A619背景，回交导入七代以上，NILA619和NILW64A分别含Ven1^A619和Ven1^W64A)。NILA619和NILW64A的蛋白和淀粉含量没有差异，但蛋白体的分布和淀粉体膜的形态存在巨大不同。授粉后18天(18 days after pollination，18 DAP)的，NILW64A胚乳细胞中蛋白体均匀分布在细胞质中，淀粉体膜的形态完整、规则；NILA619的蛋白体数量和形态都正常，但淀粉体膜呈现不规则扩张的表型。24 DAP时，NILW64A的淀粉体膜开始破裂，降解，残余膜的碎片散布在淀粉粒周围；而NILA619的淀粉体膜依然完整。30 DAP时，NILW64A的蛋白体和细胞质开始浓缩并包围在淀粉体周围，由于蛋白基质的压紧作用，淀粉粒的形态开始由圆球型变成多边形；而NILA619中的蛋白体随机分布，淀粉体膜仍然存在，形成空间阻隔切断了蛋白体与淀粉体的互作，只有少量蛋白体贴在圆球形淀粉体的表面。35 DAP是硬质胚乳形成的关键时间点，这个时期绝大部分淀粉胚乳细胞已经程序性死亡，储藏物质合成速度明显减慢，籽粒水分含量开始迅速下降，胚乳进入蜡熟期。NILW64A的蛋白体和细胞质进一步浓缩到淀粉粒表面，形成蛋白基质网格(matrix grid)；每一个蛋白基质网格紧密包埋着一颗淀粉粒，形成硬质胚乳的基本单元；无数个基本单元通过连续的蛋白基质网格而融为一体，在干燥脱水完成后形成玉米籽粒整个硬质胚乳。相反，在NILA619中的蛋白基质网格没有形成，随着籽粒脱水，内部成分开始固化，导致蛋白基质网格化更无法形成，NILA619的胚乳细胞已经展现出典型的粉质胚乳特点，即包含光滑、裸露的圆球形淀粉粒。类胡萝卜素通过影响淀粉体膜的稳定性影响硬质胚乳的形成。类胡萝卜素是一类疏水性分子，它们定位在淀粉体的膜脂中。大量研究表明类胡萝卜素能影响脂膜的物理化学性质。比如非极性的β-胡萝卜素趋向于随机分布在脂双层膜的疏水内部，从而提高膜的流动性(membrane fluidity)，而极性的类胡萝卜素呈有规则地垂周排布在脂双层膜中，它们的极性基团与膜的极带(polar zones of membrane)锚定位置相反，从而提高膜的粘度(membrane viscosity)。此外，β-胡萝卜素在VEN1作用下的产物3，3’-二羟基-β-胡萝卜素能提高磷脂膜的刚性(rigidity)。因此，在NILA619中，由于Ven1^A619的功能缺失，非极性类胡萝卜素含量上升(特别是β-胡萝卜素)而极性类胡萝卜素(特别是3，3’-二羟基-β-胡萝卜素)积累下降，导致淀粉体膜的流动性和疏水性增加，从而引起膜的不规则扩张。淀粉体膜物理化学性质的改变可能使淀粉体膜降解延迟。虽然这个过程的生化机制还有待继续研究，但我们发现A619和NILA619胚乳中的淀粉体膜特异的半乳糖基二脂酰基甘油(digalactosyldiacylglycerol，DGDG)比W64A和NILW64A中高，说明前者的淀粉体膜有更不容易被降解。相关研究发现β-胡萝卜素和3，3’-二羟基-β-胡萝卜素对清除含不饱和脂肪(比如DGDG)而不是含饱和脂肪的膜的单线态氧有效。我们推测DGDG在A619和NILA619含量更高，因此可以增加β-胡萝卜素介导的抗氧化活性，从而保护籽粒发育过程中淀粉体膜免受氧化损伤和降解。为了验证可能因非极性类胡萝卜素累积导致淀粉体膜物理化学性质变化的假说，我们通过EMS诱变A619，筛选Ven1^A619表型的抑制子(vitreous endosperm suppressor, ves)。筛选共获得四个突变体，其中两个是等位突变，它们的共同特征是类胡萝卜素合成途径有缺陷，分别命名为ves1，ves2，ves3-1和ves3-2。我们通过BSA测序克隆了这四个突变体(三个基因)，它们分别编码4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase 1(HPPD)，hydroxymethylbutenyl diphosphate synthase (HDS)和1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS)，都位于VEN1的上游。它们的功能缺失导致下游类胡萝素合成全部受到抑制，籽粒的粉质表型都恢复成了硬质表型。通过上述遗传实验，证明了Ven1^A619虽然可以有效提高维生素A源β-胡萝卜素的含量，但过度积累会导致籽粒胚乳的粉质表型。前面讲到我们在构建回交群体时，硬质和粉质表型在前两代并没有发生分离，而且分析自然群体中某些自交系含有Ven1^A619基因型却表现硬质表型，暗示自然群体中存在Ven1^A619的修饰因子(modifiers)，它们能把Ven1^A619引起的粉质表型恢复成硬质，这个现象类似于优质蛋白玉米中的opaque 2修饰因子。为研究群体中的修饰因子，我们用Ven1RNAi花粉与262份自交系杂交，发现182份材料的F₁籽粒是完全修饰的(硬质)，35份是部分修饰的(硬、粉质嵌合)，45份是完全没有修饰的(粉质)。这些结果说明自然群体存在修饰因子，但30%的自交系不含或不全含修饰因子，因此不适合作为维生素A的生物强化育种材料。通过GWAS关联分析，我们初步鉴定了基因组中修饰因子的分布位点，基因克隆、遗传功能验证及分子机制研究还在积极进行。玉米硬质胚乳形成是一个非常复杂的生理、生化过程，由多基因控制，并受遗传背景及环境因子影响。我们这项工作发现了类胡萝卜素通过影响淀粉体膜的稳定性从而影响玉米硬质胚乳形成的一个新机制。类胡萝卜素成分及含量对于玉米产量而言(至少对于淀粉合成)并没有明显作用。在白玉米(psy1弱突变体)或者含非极性类胡萝卜素低的自交系(比如VEN1功能正常的W64A)，淀粉体膜降解与蛋白体和淀粉粒的互作协同进行，这是硬质胚乳形成的先决条件。当非极性胡萝卜素含量增加时(比如VEN1功能缺失的A619), β-胡萝卜素极有可能通过特殊的物理化学性质增加了淀粉体膜的稳定性，而其在硬质胚乳形成的关键时期不易破裂降解。由于淀粉体膜的存在，它构建了一道空间屏障，阻碍了蛋白体和淀粉粒的互作，蛋白体和细胞质不能浓缩在淀粉粒表面形成致密的蛋白基质网格结构，从而干扰了硬质胚乳形成。Ven1^A619产生的粉质表型会严重限制其维生素A生物强化的利用价值。我们通过Ven1RNAi构建的高效遗传筛选系统，鉴定了自然群体中的含有Ven1^A619修饰因子的自交系材料及这些因子在基因组中的分布位点，这将为培育高β-胡萝卜素和生产加工品质好的“双优”生物强化玉米品种奠定基础。类胡萝卜素调控玉米硬质胚乳形成模型。副研究员王海海和博士后黄永财为本研究论文的共同第一作者。硕博生肖俏、黄兴、朱一栋、博士后李长生、向小利、助研王琼、副研究员王婕琛、所级平台高小彦老师、上海交通大学王文琴副教授和亚利桑那大学Brian A. Larkins教授合作参与了该项研究工作。中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿研究员为通讯作者。研究工作得到了科技部、国家自然科学基金和中国科学院先到B等项目的资助。巫永睿课题组2013-2020全体成员合影研究背后的故事1、 从另一个角度思考问题从1987年第一个经典粉质突变体opaque 2被克隆以来，已经有十多个经典粉质突变体被克隆，解析它们的分子机制极大地丰富和拓展了Donald Duvick六十年前提出的硬质胚乳形成的“混凝土”模型。然而很奇怪，虽然玉米自然群体中自交系的硬粉质程度变异很大，但到目前为止这些变异没有发现一个和已经克隆的单基因突变体存在等位变异，说明这些单基因突变会引起强烈的表型变化，在材料选择过程中很容易被淘汰。自然群体中存在的粉质材料要么大多表型不够强烈，要么可能和其它优异性状有紧密关联而保留下来。因此，从自然群体变异的角度研究硬粉质形成的遗传结构及分子机制有非常重要的理论价值和品质改良意义。我们这个工作确实发现了Ven1^A619这个等位变异是维生素A生物强化的重要基因，但自然群体中30%的自交系会因导入这个等位基因产生粉质表型。我们的发现解决了Ven1^A619应用的局限性，通过修饰因子的修饰作用，可以让绝大部分自交系能够用于β-胡萝素提升的品质遗传改良。2、 不会骗你的遗传学根据报道的十多个粉质突变体遗传表现，突变表型都是由后代基因决定的，而且表型在不同环境下都很稳定。2016年我们开始这个课题时，我们计划用F₁BC₁群体进行遗传定位，但是棒子上籽粒全是很均匀的硬质表型，没有任何性状分离。我们怀疑过材料是否弄错了，但是材料种了很多，不可能每个编号都是错的。我们又猜测A619的粉质表型可能是由母体基因型决定的，因为之前分析蛋白含量发现A619的胚乳蛋白含量明显低于W64A。这个表型是否和伊利诺低蛋白粉质材料类似？既然蛋白含量是由母体决定的，F₁BC₁的母体是杂合的，那么棒子上的籽粒不管有没有基因型分离，应该都是正常蛋白水平，所以胚乳就全部是硬质表型。然而根据我们多年研究经验，自交系蛋白含量只要不低于7%，一般不会出现粉质表型，而A619是明显高于这个水平的。为了明确A619胚乳粉质表型是否和蛋白含量有关，我们把A619和W64A的花粉等量混合后授到A619雌穗上，所得棒子的籽粒一半为粉质(相当于A619自交)，另一半为硬质(A619 x W64A的F₁)。这两种基因型籽粒的母体都是A619，但相同低蛋白水平的A619 x W64A籽粒却是硬质表型，说明W64A 和A619的硬粉质表型仍是由子代基因型控制的，和它们蛋白水平无关。我们继续回交，到了F₁BC₂还是没有表型分离，这非常不符合逻辑！即便这个粉质表型是由多个微效的QTL调控，F₁BC₂也应该有表型分离。我们于是怀疑A619的粉质表型是否真的是由遗传控制的？和环境有关吗？和粒型有关吗？玉米的杂种优势非常强烈，背景不纯有干扰吗？有抑制子吗？我们有很多怀疑和假设，但从不怀疑这个表型是由遗传控制的。不管是什么原因，决定再往前坚持走一步看看。到了F₁BC₃代，表型分离出现了，尽管不是1：1，还有中间型，但出现表型分离就说明遗传学不会骗你。再继续回交，我们就得到了孟德尔分离，接下去基因定位就进行得非常顺利。那么到底是什么原因引起前两代没有表型分离呢？我们还没有完全找到答案，但W64A存在Ven1^A619修饰因子的干扰是其中一个原因。3、 设计高效的遗传筛选系统两个表型正常的自交系放在手中，你无法知道它们是否适合做维生素A生物强化育种，因为在Ven1^A619没有导入进来之前，你不能判断这两个自交系是否含有修饰因子。Ven1^A619是隐性基因，要看表型必须要等两代以上。如果只导入少数材料很简单，但要同时判断几百、上千份材料是否含有修饰因子，工作量就巨大无比了。我们设计的Ven1RNAi转基因材料解决了这个难题，由于Ven1RNAi是显性，F₁代就可立即进行表型考察。4、 坚持不懈勇往直前的精神2020年对于每个人都是不平凡的一年。三亚南繁的材料对这个课题至关重要，一个多月在地里辛勤奋战后，玉米授粉圆满完成，期待春节后的取样和收获。春节后，疫情突如其来，王海海副研究员和黄永财博士顶着压力毅然两次逆行三亚，去取关键的科研样品并收获重要的遗传材料。隔离后，他们马上奔向田间进行重要科研材料样品的取样；然后日以继夜地加紧收获玉米材料。经过一个月的努力，最终完成了遗传材料的收获和取样工作。正是这些宝贵的样品和遗传材料才保证了VEN1工作的顺利进行！2020年疫情期间南繁材料的取样和收获。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-19196-9