马新月,柳思宇,侯静静,孙露,段瑞,杜兰兰,董林毅*

(天津医科大学药学院，天津300070)

摘要目的：本文对中药复方蛇胆陈皮胶囊的化学成分进行快速表征、鉴定，并尝试使用其特征指纹图谱进行质量控制。方法：采用UPLC-Q-TOF-MS^E对蛇胆陈皮胶囊的化合成分进行分析，并建立指纹图谱。结果：鉴定了25个化合物，并以紫外色谱图的16个共有峰建立了蛇胆陈皮胶囊的指纹图谱，并对不同批次样本进行了相似度分析，相似度计算结果均大于0.98，表明不同批次蛇胆陈皮胶囊的质量差异较小。结论：本方法为蛇胆陈皮胶囊化学成分的快速鉴定及质量评价提供了科学依据。

关键词：蛇胆陈皮胶囊；超高效液相色谱-四级杆串联飞行质谱；指纹图谱；快速表征；相似度分析

Study on ChemicalConstituents and Fingerprint of Shedanchenpi Capsules

MA Xinyue, LIU Siyu, HOU Jingjing, SUNLu, DUAN Rui, DU Lanlan,       Dong Linyi[1]^*

(Tianjn Medical University, Tianjin300070, China)

ABSTRACTObjective：To develop acomprehensive and rapid method for elucidation of the chemical composition anddetermination of the characteristic chromatographic profiles of Shedanchenpicapsules，and hence to control its quality. Methods：An UPLC-QTOF-MS^E method was developed. Shedanchenpi capsulesfingerprint was built based on 16 common peaks in the PDA chromatographicprofile．Results：Tenbatches Shedanchenpi capsules fingerprint was built based on 16 common peaks inthe PDA chromatographic profile. According to the similarity results weregreater than 0.98, the quality different were very tiny. Conclusions：The characteristic chromatographic profile of Shedanchenpicapsules with high specificity can be provided a scientific basison the qualitycontrol of the prescription．

KEYWORDS:Shedanchenpi capsules; UPLC-QTOF-MS^E;Fingerprint; Rapid characterization; Similarity analysis

蛇胆陈皮胶囊(SDCP)是由珍贵动物药材蛇胆汁和植物药材陈皮(蒸制)两味提炼而成，具有理气化痰，祛风和胃的功效。临床上主要用于痰浊阻肺、胃失和降而致的咳嗽呕逆，以及感冒所致的急慢性支气管炎等症^[1]。目前，对蛇胆陈皮胶囊的研究主要集中在临床应用和药理活性等方面。为了阐述该复方的物质基础和作用机理，以及进行更好的质量控制，其化学物质组^[2]及指纹图谱的研究十分必要。

传统的蛇胆陈皮制剂质量控制方法主要为薄层色谱鉴别法^[3]和以牛磺胆酸钠为单一指标的含量测定方法^[4]，存在步骤多、耗时长、专属性差等缺点。近年随着现代分析技术的发展，高分辨液质联用技术成为天然药物复杂体系中活性成分的快速分离和鉴定的有力手段^[5]，所得到的数据更加完整且品质更高，对于分析中药复方等成分复杂的样本具有其特有的优势。

本文首次应用UPLC-Q-TOF-MS^E技术对蛇胆陈皮胶囊进行了研究分析，根据色谱峰的精确分子量、分子碎片峰、色谱保留时间和相关文献等^[6]，从中分析鉴定了25个化合物，并以有紫外吸收的16个共有峰进行了指纹图谱分析。本研究较为全面地阐明了蛇胆陈皮胶囊的化学物质组成，为蛇胆陈皮胶囊的物质基础及质量控制等方面研究奠定了基础。

1 仪器与试药

1.1仪器

Waters Acquity ^TM超高效液相色谱系统，配置真空脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、Masslynx色谱工作站(Waters，USA)；Waters Q-TOF Premier 质谱仪(Waters MSTechnologies，Manchester，UK)；Acquity BEH C₁₈色谱柱(100 ×2.1 mm，1.7 μm)色谱柱(Waters，USA)；HU3120B 超声波仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；AB54、XS205分析天平(METTLER公司)；超纯水仪Milli-Q(MILLIPORE，USA)。

1.2试药

乙腈、甲醇，色谱纯(Fisher公司，USA)；甲酸，色谱纯(Acros，USA)；磷酸，色谱纯(广州市集华精细化工有限公司)；亮氨酸-脑啡肽乙酸盐(LEA，Sigma， USA)；超纯水由Milli-Q制备；蛇胆陈皮胶囊由江西天施康中药股份有限公司生产，(S1-1207162、S2-1208221、S3-1208053、S4-1210165、S5-1211026、S6-1212143、S7-1304111、S8-1303027、S9-1304138、S10-1304154，共计十个批次，先后分五次购于广州市同仁堂连锁药店和广州市海王星辰连锁药店)。

2 方法

2.1UPLC色谱条件

色谱柱采用Waters Acquity BEH C₁₈(2.1×100 mm，1.7 μm)；柱温30 °C；流速0.4 mL/min；PDA检测190-400 nm扫描；进样量：1.0 μL；流动相：A乙腈，B 0.05 %甲酸水溶液，A相梯度洗脱条件为：0~7min，2%~25%；7~10min，25%~45%；10~15min，45%-80%；15~16min，80%~2%。

2.2Q-TOF质谱条件

电喷雾离子源；V模式；毛细管电压2.5 kV；锥孔电压45 V；离子源温度100℃；脱溶剂气温度300℃；脱溶剂氮气流量600 L/h；锥孔气流量50 L/h；采样频率0.1 s，间隔0.02 s；记录范围50~2000 Da。负离子模式：Lockmass采用LEA([M-H]^- = 553.2775)；正离子模式：Lockmass采用LEA([M+H]^- = 555.2931)。

2.3 样品制备方法

取本品内容物约20mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加乙腈:甲醇:水(5:3:2)适量约8 mL，超声处理使全部溶解，放冷至室温后定容，过0.22 μm微孔滤膜，10000 rpm离心10min，即得供试品溶液。

2.4 蛇胆陈皮胶囊中化合物的结构分析鉴定

对蛇胆陈皮胶囊样品进行的UPLC-Q-TOF-MS，对所得谱图信息进行分析，UV色谱图为PDA检测器在190~400nm下扫描得到的各成分最大紫外吸收处的色谱相应峰行为的综合表征；通过质谱正负离子谱图得到的信息对主要色谱峰的精确分子量(误差小于5ppm)，再结合同位素匹配结果，可以推测各个色谱峰的分子式，再通过得到的分子式进入CA等数据库检索结构式，并参考蛇胆汁和陈皮单味药材中已报道的化合物结构，以及二级质谱中碎片峰的精确分子量和元素组成，就可以推测色谱峰可能的结构式。并对一些同分异构体的化合物进一步参考保留时间和化合物极性来进行推测。

2.5 蛇胆陈皮胶囊指纹图谱分析

以批次为S7-1304111的蛇胆陈皮胶囊进行方法学考察。选择强紫外吸收和分离度较好的保留时间为7.246 min川陈皮苷的色谱峰为参照峰(S)，计算色谱图中所有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，用于评价方法学考察结果。

3 结果

3.1 蛇胆陈皮胶囊中化学成分分析结果

蛇胆陈皮胶囊通过优化后的分析条件，基本可以将蛇胆陈皮胶囊中主要的色谱峰进行较好的分离和表征，并对主要的25个色谱峰进行结构鉴定并指认，1-16峰为强紫外吸收峰，J1-J9峰为弱紫外吸收峰，见表1和图1。7.246min的色谱峰在正离子模式下响应更高，一级质谱提供准分子离子峰为581.1866，通过Masslynx4.1分子量及元素分析分子式为C₂₇H₃₂O₁₄的匹配度最高(ppm为-0.860)，结合二级质谱分析丰度最高的两个中性丢失为146和162，为鼠李糖和葡萄糖的中性丢失响应，其他中性丢失还存在28的CO和18的H₂O，结合标准品的保留时间和文献汇总的化合物数据库，解析此化合物为川陈皮苷。

Figure1 UPLC-PDA profile, BPI positive and negative profiles ofthe fingerprint from SDCP

3.2 蛇胆陈皮胶囊指纹图谱分析结果

1. 3.2.1 精密度实验

按照“2.3样品制备方法”项下制备样品，连续进样6次，考察仪器的精密度。结果表明，所有色谱峰的相对保留时间基本保持一致(RSD<0.13%)，相对峰面积基本保持一致(RSD<2.89%)，符合中药指纹图谱的要求(RSD<3%)，仪器精密度良好。

1. 3.2.2 稳定性实验

同上制备样品，分别在0，2，4，8，12，24 h检测，考察样品溶液的稳定性。结果表明，所有色谱峰的相对保留时间基本保持一致(RSD<0.11%)，相对峰面积也基本保持一致(RSD<2.97%)，说明样品溶液在24 h内保持稳定。

1. 3.2.3 重现性实验

同上制备6份样品溶液，每份样品平行检测两次，考察其重现性。结果表明，所有色谱峰的相对保留时间基本保持一致(RSD<0.13%)，相对峰面积基本保持一致(RSD<2.72%)，符合中药指纹图谱研究的要求。

1. 3.2.4 指纹图谱建立与相似度评价

同上制备10个批次蛇胆陈皮胶囊的样品溶液，按照“2.1UPLC色谱条件”项下参数设置，进样检测，建立UPLC/PDA 紫外指纹图谱。采用国家药典委颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004A)软件对指纹图谱的相关参数进行自动匹配。参数设置：(1)参照指纹图谱：以批次为S7-1304111的蛇胆陈皮胶囊指纹图谱作为参照指纹图谱；(2)时间窗宽度为0.20；(3)保留时间选择范围1-20 min；(4)通过软件自动匹配10批次样本；(5)对照指纹图谱的采用平均数法，由10个批次蛇胆陈皮胶囊紫外指纹图谱生成。按照上述参数设置，提取10批次样本的共有模式建立叠加色谱图生成对照指纹图谱，标定16个色谱峰为10批次蛇胆陈皮胶囊共有峰，共有峰面积占总峰面积90%以上，16个共有峰成分鉴定结果已在“2.4 蛇胆陈皮胶囊中化合物的结构分析鉴定”项下进行表征。并以蛇胆陈皮对照指纹图谱为参照，对各批次指纹图谱进行相似度计算。结果表明，10批次蛇胆陈皮胶囊强紫外指纹图谱与对照指纹图谱的相似度计算结果均大于0.98(表2)，说明10批次具有较好的一致性，紫外指纹图谱的方法可用于综合评价蛇胆陈皮胶囊的整体质量。

1. 4. 讨论

本文采用UPLC-Q-TOF-MS^E技术对蛇胆陈皮胶囊的化学成分进行了快速表征和鉴定，成功鉴定了25个化合物的结构。现代医学研究表明，作为复方中药的制剂，蛇胆陈皮胶囊主要通过其中所含蛇胆汁和陈皮两味中药的各自作用与相互配伍发挥其抗炎平喘功效的。其中蛇胆中的胆酸类成分，是主要抗炎药效成分，可明显抑制IL-6、IL-8等炎症因子的表达，是NF-κB炎症通路的有效抑制剂^[7]；陈皮中的大量黄酮成分和主要生物碱成分辛弗林，具有明显地收缩血管、舒张支气管平滑肌等作用；并且胆酸类成分与β2受体激动剂辛弗林配伍使用，可协同增加其平喘的功效^[8]。

UPLC-Q-TOF-MS^E技术，可以快速、方便、有效地对该中成药的的化学物质组分进行指纹图谱表征和结构分析，可以比较全面地反映蛇胆陈皮胶囊中的药效物质成分，结合相似度分析在中药复杂体系分析、生产过程控制中具有巨大的应用潜力。

参考文献

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[6]  Qiao X，Ye M，PanDL，et al. Differentiation ofvarious traditional Chinese medicines derived from animal bile andgallstone: simultaneous determination of bile acids by liquidchromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry.J Chromatogr A, 2011，1218(1)：107-117.

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