使用宏基因组的方法快速鉴定新冠病毒SARS-CoV2

一、如果不考虑成本，可以使用宏基因组测序的方法来快速鉴定新冠病毒SARS-CoV2，这种方法无需扩增、分析简单、准确度高。原理是直接将测序得到的序列数据与分类物种数据库比对，从而得到鉴定结果。本文使用centrifuge工具来进行物种（病毒）分类鉴定

二、流程概览图如下，是不是很简单？

流程输入	SRR10971381_1.fastq.gz SRR10971381_2.fastq.gz 测试数据下载 SRX7636886: Complete genome of a novel coronavirus associated with severe human respiratory disease in Wuhan, China 1 ILLUMINA (Illumina MiniSeq) run: 28.3M spots, 8G bases, 2.6Gb downloads 使用NCBI官方工具sra-toolkit拆分成fastq.gz文件 fastq-dump SRR10971381 --split-3 --gzip 得到SRR10971381_1.fastq.gz SRR10971381_2.fastq.gz 分析流程文件（可一键导入sliverworkspace运行）及报告文件，conda环境文件下载，导入操作
运行环境	docker image based on ubuntu21.04 Conda Mamba（默认使用清华源） ssh
分析软件	- fastp=0.23.2 - fastqc=0.11.9 - multiqc=1.13 - centrifuge=1.0.4 pavian docker 镜像 - florianbw/pavian:latest
输出结果	multiqc_report.html 测序数据trim前后质量数据 SRR10971381.clean.report.tsv 分类鉴定报告文件 SRR10971381.clean.result.tsv 分类鉴定统计结果 SRR10971381.kraken2.report.tsv kraken格式的鉴定报告格式，便于pavian用来图形化交互分析 Uploaded_sample_set-report.html pivian导出的报告

流程输入

SRR10971381_1.fastq.gz SRR10971381_2.fastq.gz

测试数据下载
SRX7636886: Complete genome of a novel coronavirus associated with severe human respiratory disease in Wuhan, China
1 ILLUMINA (Illumina MiniSeq) run: 28.3M spots, 8G bases, 2.6Gb downloads

使用NCBI官方工具sra-toolkit拆分成fastq.gz文件 fastq-dump SRR10971381 --split-3 --gzip
得到SRR10971381_1.fastq.gz SRR10971381_2.fastq.gz

分析流程文件（可一键导入sliverworkspace运行）及报告文件，conda环境文件下载，导入操作

运行环境

docker image based on ubuntu21.04 Conda Mamba（默认使用清华源） ssh

分析软件

- fastp=0.23.2
- fastqc=0.11.9
- multiqc=1.13
- centrifuge=1.0.4

pavian docker 镜像
- florianbw/pavian:latest

输出结果

multiqc_report.html 测序数据trim前后质量数据
SRR10971381.clean.report.tsv 分类鉴定报告文件
SRR10971381.clean.result.tsv 分类鉴定统计结果
SRR10971381.kraken2.report.tsv kraken格式的鉴定报告格式，便于pavian用来图形化交互分析
Uploaded_sample_set-report.html pivian导出的报告

环境搭建: 为了快速完成环境搭建，节省95%以上时间。

本文使用docker + conda (mamba) 作为基础分析环境，镜像获取：docker/docker-compoes 的安装及镜像构建见《基于docker的生信基础环境镜像构建》,docker镜像基于ubuntu21.04构建，并安装有conda/mamba，ssh服务。并尝试初次运行时初始化安装所需软件下载所需文件（作为代价首次运行时间会较长，切需网络通畅），即实现自动初始化的分析流程。

# 拉取docker镜像
docker     pull     doujiangbaozi/sliverworkspace:latest# 查看docker 镜像
docker     images

基础环境配置，docker-compose.yml 配置文件，可以根据需要自行修改调整

version: "3"
services:SarsCov2:image: doujiangbaozi/sliverworkspace:latestcontainer_name: SarsCov2volumes:- /media/sliver/Data/data:/opt/data:rw                               #挂载原始数据，放SC2目录下- /media/sliver/Manufacture/SC2/envs:/root/mambaforge-pypy3/envs:rw  #挂载envs conda环境目录- /media/sliver/Manufacture/SC2/config:/opt/config:rw                #挂载config conda配置文件目录- /media/sliver/Manufacture/SC2/ref:/opt/ref:rw                      #挂载reference目录- /media/sliver/Manufacture/SC2/result:/opt/result:rw                #挂载中间文件和输出结果目录ports:- "9024:9024"                                                        #ssh连接端口可以按需修改environment:- TZ=Asia/Shanghai                                                   #设置时区- PS=20191124                                                        #修改默认ssh密码- PT=9024                                                            #修改默认ssh端口

基础环境运行

# docker-compose.yml 所在目录下运行
docker-compose up -d# 或者
docker-compose up -d -f /路径/docker-compose.yaml# 查看docker是否正常运行,docker-compose.yaml目录下运行
docker-compose ps# 或者
docker ps

docker 容器使用，类似于登录远程服务器

# 登录docker，使用的是ssh服务，可以本地或者远程部署使用
ssh root@192.168.6.6 -p9024# 看到如下，显示如下提示即正常登录
(base) root@SliverWorkstation:~#

三. 分析流程

变量设置：

#样本编号
export sn=SRR10971381
#数据输入目录
export data=/opt/data
#数据输出、中间文件目录
export result=/opt/result
#conda安装的环境目录
export envs=/root/mambaforge-pypy3/envs
#设置可用线程数
export threads=8

数据简单过滤：

#conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
if [ ! -d "${envs}/qc" ]; thenmamba env create -f /opt/config/qc.yaml
fisource activate qcmkdir -p ${result}/${sn}/clean
mkdir -p ${result}/${sn}/qcfastqc ${data}/SC2/${sn}_1.fastq.gz ${data}/SC2/${sn}_2.fastq.gz -o ${result}/${sn}/qcfastp -w ${threads} -i ${data}/SC2/${sn}_1.fastq.gz -I ${data}/SC2/${sn}_2.fastq.gz \-o ${result}/${sn}/clean/${sn}_1_clean.fastq.gz -O ${result}/${sn}/clean/${sn}_2_clean.fastq.gz \-h ${result}/${sn}/qc/${sn}_fastp.html -j ${result}/${sn}/qc/${sn}_fastp.json fastqc ${result}/${sn}/clean/${sn}_1_clean.fastq.gz ${result}/${sn}/clean/${sn}_2_clean.fastq.gz \-o ${result}/${sn}/qcmultiqc ${result}/${sn}/qc/ -f -o ${result}/${sn}/qcconda  deactivate

Centrifuge 对序列进行物种鉴定

#conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
if [ ! -d "${envs}/centrifuge" ]; thenmamba env create -f /opt/config/centrifuge.yaml
fisource activate centrifugeif [ ! -f "/opt/ref/centrifuge-idx/hvc.4.cf" ]; thenmkdir  -p /opt/ref/centrifuge-idxaria2c https://zenodo.org/record/3732127/files/h+v+c.tar.gz?download=1 -d /opt/ref/centrifuge-idxtar -zxvf /opt/ref/centrifuge-idx/h+v+c.tar.gz "/opt/ref/centrifuge-idx"
ficentrifuge \-x /opt/ref/centrifuge-idx/hvc \-1 ${result}/${sn}/clean/${sn}_R1.fastq.gz \-2 ${result}/${sn}/clean/${sn}_R2.fastq.gz \--report-file ${result}/${sn}/${sn}.clean.report.tsv \-S ${result}/${sn}/${sn}.clean.result.tsv \-p ${threads}conda  deactivate

Centrifuge输出结果转换为kraken格式，便于pavian交互式分析

source activate centrifugecentrifuge-kreport \-x /opt/ref/centrifuge-idx/hvc \${result}/${sn}/${sn}.clean.result.tsv > ${result}/${sn}/${sn}.kraken2.report.tsvconda  deactivate

pavian docker运行，配置docker-compose.yaml如下

version: "3"
services:pavian:image: florianbw/pavian:latestcontainer_name: pavianports:- "5000:80"

运行docker镜像：docker-compose.yaml文件相同目录下运行：

#运行docker镜像
docker-compose up -d#查看docker容器运行情况,docker-compose.yaml相同目录下运行
docker-compose ps#或者
docker ps

pavian容器运行起来之后，打开浏览器，地址栏输入http://localhost:5000,可以看到如下图：

点击右侧Browse按钮，上传输出文件SRR10971381.kraken2.report.tsv

点击左侧按钮可以看到图形化分析结果，比对上的16.2%；没比对上的83.8%
点击左侧Sample可以看到桑基图如下：Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 59.5k，结果很明显了。
可以点击左侧Generate HTML report导出该报告: Uploaded_sample_set-report.html