文献解读|植物对低温胁迫的反应：低温胁迫改变了大白菜的抗氧化代谢能力

TITLE：Plant Response to Cold Stress: Cold Stress Changes Antioxidant Metabolism in Heading Type Kimchi Cabbage（Brassica rapa L. ssp. Pekinensis）
译名：植物对低温胁迫的反应：低温胁迫改变了大白菜的抗氧化代谢能力
期刊：Antioxidants
日期：2022年4月
下载链接：https://www.mdpi.com/2076-3921/11/4/700

研究介绍：
冷胁迫是世界重要的经济作物大白菜（HtKc，Brassica rapa L.ssp.pekinensis）重要的产量限制因子。然而，HtKc对低温胁迫的生化和分子响应还不清楚。在本研究中，研究者对正常和低温条件下生长的HtKc进行转录组分析，以研究HtKc对低温胁迫响应的分子机制。共有2131个基因（936个上调，1195个下调）被鉴定为差异表达基因，并被显著注释为“刺激反应”类别中。此外，低温胁迫通过诱导苯丙素途径导致HtKc中，包括对香豆酸、阿魏酸和芥酸在内的多酚类化合物的积累。化学抗氧化实验结果表明，低温诱导的多酚类化合物提高了HtKc清除自由基的清除活性和抗氧化能力，表明低温胁迫诱导的苯丙素途径有助于HtKc抵抗低温诱导产生的活性氧。综上所述，研究结果将为通过增强抗氧化机制来提高植物的耐寒性提供重要的基础。
研究目的：
为进一步了解大白菜的冷反应提供了依据；揭示了苯基丙类途径在冷胁迫下控制细胞氧化还原稳态的作用；概述了HtKc中冷胁迫引发的分子反应，并将作为未来研究的公开可用资源，通过操纵抗氧化机制来提高环境压力耐受性。
材料与方法：
材料：
HtKc（品种Chunkwang）的种子发芽并在温室（20°C）中生长。幼苗以均匀状态生长50 d，然后转移到极端天气生长室（EGC）进行冷处理。一半的植物在20°C下生长作为对照植物，其余的在冷胁迫（10°C）下1天（C1d）或3天（C3d）下生长。五个生物重复。
方法：
HtCc对冷应激的生理反应
使用便携式LI-COR气体交换系统（LI-COR）分析了冷应力对光合速率和气孔导度的影响。
脯氨酸含量使用比色法定量。脯氨酸用各种浓度的标准品制备的校准曲线测定脯氨酸量，并以ng /mg鲜重（FW）表示。
抗氧化酶的活性分析
为了分析SOD，CAT和POD活性，使用20mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5）提取总蛋白，并根据Bradford方法定量。使用 SOD 检测试剂盒-WST（Sigma-Aldrich）、Amplex Red过氧化氢酶检测试剂盒（Molecular Probes）和Amplex分析SOD、CAT 和 POD 活性™红色过氧化氢/过氧化物酶检测试剂盒（Invitrogen）。
转录组分析：
转录本水平表示为使用HTSeq计数和DESeq2映射的每百万条reads中每千基转录本的片段。DEG是根据p值＜0.01和|log2（FC）|≥ 1。DEGs的表达水平显示为FPKM值的Z-scores。
Blast2GO（https://www.blast2go.com/）用于DEG的GO富集。此外，使用MapMan绘制了代谢概述图（http://mapman.gabipd.org/）。
qRT-PCR分析
为了验证在转录组学数据中观察到的表达模式，选择了参与光系统II（PSII）和I（PSI）的基因进行qRT-PCR分析。基因的转录水平归一化为内部参考基因肌动蛋白。
HtCc提取物的非酶抗氧化能力分析
将冻干样品在室温下在MeOH中浸泡24小时。过滤后，使用旋转真空蒸发器蒸发MeOH提取物。使用1，1-二苯基-2-苦味酰肼（DPPH）测定测定每种提取物的自由基清除活性，并进行氧自由基抗氧化能力（ORAC）测定，两者均由Kim等人描述。DPPH值表示为减少一半DPPH自由基所需的浓度（IC50），ORAC值表示为Trolox当量（μM TE）的μM。
高效液相色谱分析
使用配备二极管阵列检测器和Poroshell 120 EC-c18色谱柱（4.6 ×150 mm，4μm）测定对香豆酸，阿魏酸和芥子酸的含量。流动相由蒸馏水中0.1%甲酸（流动相A）和乙腈含0.1%甲酸（流动相B）组成。通过比较样品的保留时间和紫外光谱数据与标准品，测定了每种提取物中对香豆酸，阿魏酸和芥子酸的含量。

结果：

图1、大白菜对低温胁迫的生理响应。测定冷处理后脯氨酸（A）、光合速率（B）、气孔导度（C）和选定基因表达量（D）的变化。数据以平均值±标准差表示。采用Duncan多范围检验，图中不同字母表示组间存在显著差异。C0，植物生长在20◦C（对照植物）；C1d和C3d，植物承受冷应力（10◦C）分别为1天和3天。

图2、大白菜的低温诱导差异表达基因（DEGs）。DEGs （C1d vs C0，C3d vs C0）火山图（A）和Venn图（B）分析。基于2131个DEGs的GO富集分析（C）。（D） ICE-CBF-COR级联中各DEGs的z得分表达热图。C0，植物生长在20◦C（对照植物）；C1d和C3d，植物承受冷胁迫（10◦C）分别为1天和3天。红色到绿色表示原始z分数。红色和绿色分别表示上升和下降的z分数。

图3、冷胁迫对光反应相关基因转录水平的影响。C0，植物生长在20◦C（对照植物）；C1d和C3d，植物承受冷应力（10◦C）分别为1天和3天。红色和绿色分别表示上升和下降的z分数。

图4、冷胁迫对抗氧化酶活性的影响（A）和冷诱导的编码抗氧化酶的差异表达基因（B）。数据以5个独立实验的平均值±标准差表示。不同字母表示组间存在显著差异。红色和绿色分别表示上升和下降的z分数。C0，植物生长在20◦C（对照植物）；C1d和C3d，植物承受冷胁迫（10◦C）分别为1天和3天

图5、低温胁迫对苯丙素途径的影响。（A）参与苯丙素途径的冷诱导差异表达基因。（B）采用高效液相色谱法评估对香豆酸、阿魏酸和芥子酸的水平。数据以平均值±标准差表示。Duncan多元极差测验显示，不同字母表示组间具有显著性差异。C0，植物生长在20◦C（对照植物）；C1d和C3d，植物处理冷应力（10◦C）分别为1天和3天。PAL，代表苯丙氨酸解氨酶；C4H，代表肉桂酸4-羟化酶；4CL，4-香豆素:辅酶A连接酶；CCoAOMT，代表咖啡酰CoA，3-O-甲基转移酶；COMT，代表咖啡酸/5-羟基阿魏酸3-O-甲基转移酶；CCR，代表肉桂酰辅酶A还原酶；CAD，代表肉桂醇脱氢酶；SCT，代表芥子酰基葡萄糖:胆碱芥子酰转移酶；CHR，代表查尔酮还原酶；CHS，代表查尔酮合成酶；CHI，代表查尔酮异构酶；F3H，代表黄烷酮3-羟化酶；F3′H，代表黄酮类3′-羟化酶；F3′5′H，代表黄酮类3′5′-羟化酶；FLS，代表黄酮醇合成酶；DFR，代表二氢黄酮醇还原酶；LDOX，代表白花青素双加氧酶；UGT，代表UDP-葡萄糖醛酸/葡萄糖基转移酶。
在这里插入图片描述

图6、采用DPPH自由基清除（A）和ORAC（B）测定化学基础抗氧化活性。清除DPPH自由基的清除活性和ORAC值分别以IC50和Trolox µM当量表示。平均值±标准差表示（n=5）。Duncan多元极差测验显示，不同字母代表组间存在显著性差异。C0，植物生长在20◦C（对照植物）；C1d和C3d，植物处理冷应力（10◦C）分别为1天和3天。
结论：
了解作物响应低温胁迫的分子机制是提高植物抗寒性的重要步骤。本文综述了低温胁迫下HtKc的分子变化。低温诱导的DEGs表现出不同的抗氧化成分表达模式。此外，基于化学的抗氧化活性分析表明，通过苯丙素途径的诱导，多酚类化合物的积累可能是该植物对冷胁迫的主要反应，而多酚类化合物已被证明可以消除HtKc中低温诱导的ROS。因此，未来的研究应更深入地研究多酚类化合物的功能应用，以提高其耐寒性。研究者坚信，研究者的数据为进一步研究HtKc响应低温胁迫的生化和分子机制提供了坚实的基础。

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