冬眠蝙蝠的脑蛋白质组与肝蛋白质组研究

【摘要】：冬眠是动物体通过降低体温、代谢速率和许多其它生理指标来应对恶劣环境的生存方式。蝙蝠是唯一具有飞行能力的哺乳类动物,种类占到哺乳类动物中的20%。从分类学的角度来看,蝙蝠归属于翼手目,分为阴亚目和阳亚目两大类。具有冬眠能力的蝙蝠物种在阴、阳亚目中均有分布；而不具有冬眠能力的蝙蝠物种只存在于阴亚目中。目前对于调控蝙蝠冬眠的分子机制仍不是很清楚。所以本项研究首先通过蛋白质组学技术,分别比较脑蛋白质与肝蛋白质在蝙蝠冬眠前后的表达变化,对蝙蝠的冬眠过程进行深入了解。其次分别选取具有代表性的目标蛋白质,通过蛋白免疫印迹、分子进化、活性测定、蛋白质结构模拟、免疫组化等手段,进一步研究冬眠相关的分子调控机制。本论文主要由三部分组成,分别为：

(1)运用蛋白质组学技术比较大足鼠耳蝠(Myotis ricketti)在冬眠和活跃两个时期脑蛋白质与肝蛋白质的表达水平差异。研究结果显示：1)在脑组织中,21%(23种)的鉴定蛋白质与氨基酸代谢、蛋白稳态相关。在冬眠期有多类蛋白质的表达水平发生改变,包括参与能量代谢的蛋白质(15种)、细胞骨架蛋白质(18种)及应激蛋白质(13种)等,其中大于30%(34种)的蛋白质与线粒体功能相关。对PDHB、DLD及ARG1蛋白质的翻译后修饰(PTMs)进行检测,发现冬眠蝙蝠可能通过PTMs方式调控蛋白质功能。此外,冬眠蝙蝠采用的抗氧化及应激手段与冬眠松鼠相近,这表明小型冬眠动物采用相似的策略以防止脑组织损伤。由于在线粒体内代谢的多种氨基酸参与调控神经传导,所以进一步揭示了线粒体在蝙蝠冬眠期间对神经通信、代谢调控及脑细胞存活方面的重要性。2)在肝脏组织中,参与糖代谢、脂代谢及氨基酸代谢的蛋白质表达水平呈现出不同的变化趋势。与活跃期的肝蛋白质表达水平相比,冬眠期中参与糖代谢的酶类表达量普遍下降,参与脂肪代谢的许多酶类表达量上升。这说明了在蝙蝠冬眠时能量供应的主要方式已由活跃时期的糖代谢转为脂类分解。大部分参与合成、折叠的蛋白质含量显著上升；而结构性蛋白质的表达量有所下降、一些参与氨基酸(如Phe、Tyr)代谢的蛋白质含量升高,说明冬眠蝙蝠可以通过消耗氨基酸来获得所需能量。同时,相关转录因子(如PPARs和HNFs)可能与冬眠能量调控有着密切的关系。

(2)在全脑蛋白质组研究中,我们发现BHMT在大足鼠耳蝠(Myotis ricketti)的冬眠期升高表达,因而对此现象所代表的生理意义做进一步探讨。已知BHMT的主要功能是代谢同型半胱氨酸(Hcy),并且在代谢Hcy时无需辅酶的协助；而Hcy含量的升高可以提高脑血管和神经退行性疾病的发病率。因此我们推论在大足鼠耳蝠冬眠期高表达的BHMT,应是蝙蝠保护脑组织在冬眠期间不受损伤的重要因子。经检测,BHMT在脑组织中的表达区域主要集中在基底核的杏仁核和大脑皮层区,其中在冬眠期的大脑皮层区BHMT表达水平显著升高。在哺乳动物中,维生素B族的补充可以有效降低Hcy水平；而我们发现尽管蝙蝠在冬眠时,脑组织中维生素B含量水平下降,但Hcy含量却没有升高,并且在维生素B6和B12含量水平较低时,参与Hcy代谢的另外两个主要酶(MS和CBS)表达水平没有改变。由此推论BHMT在冬眠蝙蝠的脑组织中可能扮演着保护神经的角色。这是第一次在哺乳类动物中明确指出BHMT在脑组织中有表达。对此系统的进一步研究将利于我们对脑血管及神经退行性疾病的生物医学认识。

(3)在肝蛋白质组研究中,我们进一步发现参与Phe和Tyr代谢的5个酶中,有3个酶(包括PAH、HGD及FAH)的表达水平在冬眠期共同上升,这在两类亲缘关系较远的蝙蝠物种(Myotis ricketti和Rhinolophus ferrumequinum)中均得到了证实。Phe和Tyr均为生糖和生酮氨基酸,Phe的含量水平在冬眠蝙蝠的肝脏中有显著下降,说明了这条代谢途径在能量供应方面的重要性。此外,Phe和Tyr代谢途径上的任何缺陷都会引起有毒代谢物质的积累,所以这也从另一角度表明了这些酶类在蝙蝠冬眠期间有解毒作用。与不具有冬眠能力的蝙蝠相比,Pah、Hpd和Hgd基因在冬眠蝙蝠中更为保守,且这些保守的氨基酸通常位于对酶结构和活性有重要影响的位置上。该研究为冬眠蝙蝠在氮代谢及有害代谢产物的清除方面提供了全新的视角与观点。

综上所述,本研究分别对脑蛋白质及肝蛋白质在蝙蝠冬眠前后的表达水平作了整体比较,从糖代谢、脂代谢、氮代谢、抗氧化、应激反应及细胞骨架结构等多角度依次归类总结；第一次发现了BHMT蛋白在哺乳类动物脑组织中的表达,证明了其在冬眠期间保护脑组织的功能与医学意义；从代谢通路的角度验证了肝脏PAH、HPD、HGD及FAH在Phe和Tyr代谢途径中的重要作用,揭示了这条代谢途径在冬眠蝙蝠中的作用价值。以上研究结果不仅有利于全面深入了解哺乳动物的冬眠现象,同时也为冬眠在转化医学方面的应用提供了十分重要的理论依据。