研究生阶段记录3-PCR介绍

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4分32秒开始讲的是PCR扩增，可以看一看。

PCR全称Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应。1985年由DR. Mullis提出，并因此在1993年获得了诺贝尔化学奖。

PCR最简单的理解就是：一种在体外，可以以指数扩增特定核酸的技术。

PCR反应和细胞内的DNA复制相似，也是一个重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程，这些过程都是通过控制反应体系的温度来实现的。

PCR主要包含三步：

（1）变性 denaturation

加热至95℃，维持15-30s，使目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应的模板。

（2）退火 annealing

冷却至55℃，引物与DNA模板的互补区域结合，形成模板-引物复合物。

（3）延伸 elongation

升温至72℃并维持一段时间，引物在耐热DNA聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸（dNTP）作为底物，合成新的DNA链。

以上三步作为一个循环重复进行，每一循环的产物作为下一循环的模板。

PCR反应体系包括：需要扩增的模板、一对寡核苷酸引物、维持pH值的反应缓冲系统、一价或二价阳离子、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸、催化依赖模板的DNA合成的耐热DNA聚合酶以及PCR促进剂等。

（1）模板 template

PCR反应的模板可以使DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，先经过反转录生成cDNA然后再进行PCR反应。PCR反应体系中对模板的要求有：DNA模板来源广泛，但待扩增的模板都需要经过纯化处理以除去DNA聚合酶抑制剂；含有目标靶序列的模板DNA可以通过单链或双链的形式加入PCR反应体系中；环状DNA复性太快使其扩增效率略低于线性DNA，一般使用线性DNA分子，如果模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子；通常小片段模板DNA扩增效率高于大分子，因此一般在PCR反应前使用机械剪切或者限制性内切酶消化基因组DNA以提高产量；选择适宜的模板量。

（2）引物 primers

引物是两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸。

（3）反应缓冲系统 reaction buffer system

反应缓冲系统提供PCR反应所必需的、合适的酸碱度和某些离子。

（4）二价阳离子Mg2+ divalent cations

所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子，通常用Mg2+。PCR反应中耐热DNA聚合酶的活性与反应体系中游离Mg2+浓度直接相关。反应体系中Mg2+浓度低时，酶的活力显著降低；过高时，酶则催化非特异性扩增。此外Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。

（5）三磷酸脱氧核苷酸 dNTP

dNTPs为PCR反应的合成原料。在标准的PCR反应中各种dNTP的浓度应相等，若任何一种浓度明显不同于其他几种时，会诱发聚合酶的错误掺入而降低链合成的速度。dNTP的浓度直接影响到PCR反应的速度和特异性，因此应严格的控制PCR反应体系中dNTP的浓度。

参考：

1.苏慧慈，刘彦仿.原位PCR[M]，科学出版社，p6.

2.王廷华，景强，Pierre Dubus.PCR理论与技术[M]，科学出版社.

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