文章：叶绿体 rRNA 甲基转移酶 CMAL 在核糖体形成和植物发育中的关键作用

本文为 The critical function of the plastid rRNA methyltransferase, CMAL, in ribosome biogenesis and plant development 的阅读笔记。原文内容参见 https://academic.oup.com/nar/article/48/6/3195/5755887

INTRODUCTION

核糖体 RNA（rRNA）中核苷酸的甲基化是在所有活生物体中普遍存在的特征。目前对 RNA 甲基化酶的结构及其如何对 RNA 进行甲基化有了一定的了解，但是对质体中 RNA 甲基化过程以及甲基化对生理过程的影响仍然知之甚少。迄今为止，在植物叶绿体内通过实验鉴定出了三种形式的 RNA 甲基化，但尚未有人研究出导致上述 RNA 甲基的甲基转移酶。本研究中，作者在拟南芥的叶绿体中鉴定出了一种 rRNA 甲基转移酶 CMAL（Chloroplast MraW-Like）。 CMAL 可以将叶绿体 16S rRNA 中第 1352 个核苷酸的胞嘧啶 C 上的第 4 个 N 添加甲基，在细菌中的同源基因为 MraW。敲除拟南芥中的 CMAL 基因可以观察到叶绿体中核糖体积累量减少，导致 mRNA 的翻译效率降低。同时作者发现，CMAL 的敲除除了导致叶绿体功能缺陷外，还会导致叶和根以及整体植物的发育异常。进一步的研究表明，cmal 植株中生长素的含量、分布和极性运输相比 WT 都具有显著性差异。作者猜想叶绿体核糖体可能参与了生长素合成的中间环节，cmal 对叶绿体内核糖体的影响导致生长素合成受到影响，生长素含量降低，而 cmal 与 WT 植株间生长素分布和极性运输的差异可能是生长素变化而导致的次级效应，进而影响了植株的整体发育。

RESULTS

一、cmal 突变体在多方面具有发育缺陷

透射电镜表明类囊体的发育受到损害（图 B）。
植株根茎叶的生长发育受阻，植株生长缓慢且矮小（图 C，D）。cmal 的根表皮细胞比野生型（wild type，WT）的短，表明 cmal 的根表皮细胞的伸长受到了抑制（图 E）。将植株从 MS 培养基（MS 培养基是 Murashige 和 Skoog 两人于 1962 年设计的，该培养基能满足植物细胞的营养和生理需要，适用范围比较广，是多数植物组织培养的基本培养基）转移到土壤后，cmal 植株仍生长缓慢，并且开花时间相应地延迟了。成熟时，cmal 植株根短且多分支，表型与 WT 区别明显。为了排除植株矮小是生长缓慢的原因，作者比较了 WT 第 6 周和 cmal 第 12 周的表型（图 F），可以发现生长确实受到了明显的抑制。作者根据这些生长发育的缺陷猜想可能是 生长素缺陷 所导致的。
光学显微镜显示 cmal 中根尖的淀粉水平较低（碘染色，图 S1），说明在cmal中淀粉质体的发育也受到了影响。
在MS培养基中外源提供的蔗糖无法缓解根部的发育缺陷（图 S2），说明缺陷不仅是由于cmal光合作用缺陷引起的。

上述的部分发育障碍在其他叶绿体功能异常的突变体中很被少观察到。作者认为 CMAL 不仅仅作用于叶绿体。

二、CMAL 编码叶绿体中 rRNA 的甲基转移酶

cmal 突变株是 AT5G10910 基因（编码 CMAL 蛋白）的第二个内含子中有 T-DNA 插入，导致 AT5G10910 的 mRNA 丢失。当向 cmal 中外源导入正常的 AT5G10910 基因时，植株表型完全恢复至野生型。上述结果证明确实是 AT5G10910 的突变导致植株出现各种生长发育缺陷，而不是与 AT5G10910 关联的基因，或同时突变的其他基因。

CMAL 蛋白由 434 个氨基酸组成，与细菌中的甲基转移酶 MraW 有显着的同源性，由内共生假说，作者猜想 CMAL 可能在质体中发挥作用。作者通过 TargetP、Predotar 两种算法预测 CMAL 的 N 端包含叶绿体转运肽。实验在叶肉细胞中使用 CMAL-GFP 融合蛋白对 CMAL 进行了定位，发现 CMAL 确实位于叶绿体中（图 2A），其中 RbcS 蛋白位于叶绿体中，FRO1 蛋白位于线粒体中，FBR1 蛋白位于细胞核中。对比 RbcS-GFP 结果，作者认为 CMAL-GFP 产生的荧光信号位于叶绿体的拟核上。为了证明猜想，作者将红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）与 pTAC5 构建在一起，其中 pTAC5 是一种已知的拟核定位蛋白。 CMAL-GFP 和 pTAC5-RFP 的荧光信号证实了作者的猜想。作者还测定了 CMAL 在拟南芥不同组织中差异表达的情况。发现 CMAL在多种植物组织和器官中广泛表达。

三、CMAL参与叶绿体16S rRNA中C1352的N4-甲基化

与 CMAL 同源的大肠杆菌 MraW 蛋白 RsmH 负责 16S rRNA 第 1402 个核苷酸上胞嘧啶 C 第 4 个 N 的甲基化（N4MN_4MN4M-C1402C_{1402}C1402）。基于内共生假说，作者猜想 CMAL 也会甲基化修饰叶绿体中的 16S rRNA。作者将大肠杆菌 16S rRNA 的 C1402C_{1402}C1402 附近位置序列与拟南芥叶绿体中 16S rRNA 的序列比对，将 C1402C_{1402}C1402 对应到拟南芥的 C1352C_{1352}C1352 位点。并且作者发现此片段序列在植物中非常保守（图 3A）。作者猜想 CMAL 可能参与了叶绿体中 16S rRNA N4N_4N4-C1352C_{1352}C1352 的甲基化。（图中蓝色星号代表 1352 位点）

为了验证猜想，作者首先测定了 cmal 和 WT 植物中 C1352C_{1352}C1352 位点的甲基化情况。将 16S rRNA 反转录后发现，cmal 中第 1352 个核苷酸与 DNA 序列一致，均为 T，而 WT 中为 C，与 DNA 序列不一致，说明在 WT 的该位点出发生了甲基化，而在 cmal 中没有（图 3B）。除 C1402C_{1402}C1402 外，作者还将大肠杆菌 rRNA 其他位点的甲基胞嘧啶比对到了叶绿体 rRNA 上，并测定了这些位点在 WT 和 cmal 中的甲基化情况，发现并没有区别，即 CMAL 不参与修饰这些位点的甲基化。

四、cmal 的叶绿体内核糖体积累量减少且翻译活性降低

为了分析 N4MN_4MN4M-C1352C_{1352}C1352 对叶绿体内核糖体完整性和功能的可能影响，我们使用免疫印迹通过观察 cmal 和 WT 植株中叶绿体内核糖体蛋白和 rRNA 染色的深浅来判断其含量的高低。作者用 RPS5 和 RPL4 的含量分别代表 30S 和 50S 核糖体亚基的含量，发现在 cmal 突变体中，RPS5 和 RPL4 的含量均显著降低。对 rRNA 含量的测定中发现，16S rRNA（1.5kb分子）的丰度在 cmal 中显着降低，而其前体 rRNA（1.7kb）的丰度则增加。作者同时测定了线粒体中 18S rRNA 的丰度，发现没有变化，说明线粒体核糖体的积累不受 CMAL 的影响。鉴于 cmal 中 rRNA 和核糖体亚基蛋白含量较少，作者还测定了几种 cmal 和 WT 中由叶绿体编码蛋白的含量，发现其中大部分蛋白含量在 cmal 中都显著降低。

五、cmal 中生长素信号的改变

为了进一步阐明 CMAL 在发育调控中的作用，测定了 WT 和 cmal 中各基因的表达量，确定了 1688 个表达量存在差异的基因（differently expressed genes，DEGs）。KEGG 对 DEGs 进行了注释，发现高 P 值的 DEG 参与的通路包括抗病，植物激素信号转导、类胡萝卜素合成等。考虑到 cmal 突变体存在明显的发育缺陷，作者着重研究了与生长素转导有关的 DEGs。发现有 23 个与植物早期生长素应答相关的基因，3个与生长素合成相关的基因，2个生长素水解酶基因在 DEG 中被富集。作者通过对生长素的含量、分布（DII-VENUS）、极性运输（PIN）三个角度的实验验证了生长素在 WT 和 cmal 中确实存在差异并解释了植株根短叶窄的原因。但作者没有进一步阐明 CMAL 如何调控生长素的生物学机理。

在生长素的信号传导中，细胞会根据外界生长素的浓度而发生不同类型的响应。Aux/IAA 蛋白在细胞对生长素响应过程的早期发挥作用，其转录量受生长素诱导可快速上调，同时由于其半衰期很短，可以作为实时反映细胞内生长素浓度的指示剂。DII-VENUS 是一种基于 Aux/IAA 蛋白开发出来用于实时反映细胞内生长素浓度的指示剂，该指示剂目前已经被广泛应用于植物生长素分布的研究。DII-VENUS 是指在 Aux/IAA 蛋白的 2 号结构域（Domain II，DII）上连接一个 VENUS 蛋白（VENUS 蛋白是一种黄色荧光蛋白）。作者通过 DII-VENUS 发现 cmal 与 WT 在根尖的生长素分布上有显著差异。（图 D）

PIN 家族蛋白与生长素的极性运输有关。定位在细胞膜上的生长素输入载体和输出载体的协同作用，保证了生长素从细胞的一端运送到另一端，实现了生长素的极性运输。PIN 家族蛋白是定位在细胞膜上的生长素输出载体，在拟南芥中 PIN 家族基因共有８个（PIN1－PIN8），功能相近但在植株体内的分布存在差异。PIN1 主要在维管组织分化中起作用，PIN2 主要在植物根向地性生长中起作用。作者通过对 PIN1、PIN2 蛋白的荧光定位（GFP）来分析生长素在组织内的极性运输情况。实验发现，PIN1、PIN2 在 cmal 突变株内含量相比 WT 极低，说明 cmal 内生长素的极性运输可能由于相应蛋白的缺失而遭到了破坏。（图 E）

Summary

在阅读完整篇文章后我们可以看到，在 “基因差异 -> 表达量差异 -> 代谢产物差异 -> 表型差异” 这条完整的逻辑思路中，作者只是证明了：

CMAL 表达量与生长素相关基因表达量的相关性（cmal 和 WT 的 DEGs + 基因注释）
CMAL 与生长素的相关性（cmal 和 WT 的生长素分布差异）
CMAL 与表型之间的相关性（cmal 中导入 CMAL 基因后植株表型恢复正常）

而没有证明：

CMAL 与生长素相关基因的互作机理（未知）
生长素相关基因的功能注释是否准确
生长素是否是表型差异的真正原因或唯一原因（作者利用大家对生长素公认的功能来解释表型差异的成因）

这里作者选择生长素往下研究就很讲究，在 cmal 和 WT 的 DEGs 中，其实 DEGs 中任意一个基因往下做大多都可以得到 CMAL 与其相关的结论，问题在于基因的功能能否解释 cmal 与 WT 的表型差异，即上述的逻辑链条是否能完整。选择生长素就很讨巧，一方面生长素被研究的比较透彻，功能得到了大家的公认，无需再证明生长素和表型的关系；另一方面生长素有大量的实验研究，并且由于是基本激素，在大量的通路中都有涉及，方便作者在无法证明机理的情况下提出自己的猜想。根据我目前的研究经验，上面这两点证明是在挖掘新基因功能时十分难做的。经常挖到的基因上下游不清楚，或者上下游基因功能不清，或者上下游基因功能和表型没有已有的实验支持他们相关，很难再往下研究了。作者通过研究生长素而解决了上述问题，选择一个可研究的方向是极为重要的。