PacBio三代宏基因组测序大幅提升海洋水体宏基因组研究效果

期刊名：Frontiers in Microbiology

影响因子：5.64

背景介绍

三代测序的读长长，但错误率较高，且宏基因组的组装软件大都是基于二代测序设计，所以在既往的宏基因组学研究中较少用到三代测序数据，然而二代测序在宏组学研究中仍存在一些技术局限，如在相似性较高的微生物组和原核基因组中，短reads的组装效果不佳。本文以冬季地中海混合水样为研究对象，深入比较二代测序与三代测序数据对宏基因组组装注释的效果。

实验设计

将PacBio Sequel II的长读长（LRs）与经典方法—使用Illumina Nextseq短读长（SRs）序列进行宏基因组研究及组装的比较。

组装方法

数据来源	组装方法
二代产生的短读长SRs	IDBA-UD
三代产生的长读长LRs	Canu和MetaFlye
二代+三代	metaSPAdes

主要结论

长读长测序技术性价比更高

在同等成本下，PacBio测序产生的原始数据可达Illumina测序数据的18倍。

更高的分类分辨率和可靠性

LRs基因片段可以提高16S rRNA的分类，减少未实现分类的reads数量(0.4% LR和1.3% SR)，LRs用于宏基因组学组装可以避免组装过程中的错误，因此具有更高的分类分辨率和可靠性。

得到更优质的组装序列

结果显示，由CCS组装得到的序列优于IDBA SR（SRa），metaSPAdes CCS5获得的最大contig长度可达2.6 Mb，比SRa组装结果高一个数量级；metaSPAdes CCS5的平均contig大小也比SRa高7倍；使用metaSPAdes和CCS15池实现了最好的装配结果。

组装无偏好

通过比较LRs组装与SRa组装在门水平的分类差异来验证metaSPAdes CCS15的组装是否具有偏向性，发现这两种方法均可以有效回收所有菌门，仅存在数值上的差异，该结果证实了metaSPAdes CCS15在组装微生物基因组过程中没有产生过大偏好。

补齐经典MAGs的短板

对于外界环境中一些最普遍存在的菌，经典MAG的产出率很低，如远洋细菌(Pelagibacterales)在上层海洋水域占主导地位，但在通过宏基因组研究检索到的MAGs数量相对较少，目前公共存数据库中只有34个MAGs(中等质量，50%完整，5%污染)，另一个例子是Ca. Actinomarinales ，它是广泛分布在海洋中的一种放射线细菌，公共存数据库只有7个MAGs。这种异常现象的原因尚不清楚，可能是这些微生物具有高度的序列微多样性特征。LR宏基因组组装大大提高了这两类微生物的组装效果。LRa的数据量是SRa的6倍，并且有更长的contigs，这有助于恢复完整的MAGs。

更强的基因筛选能力

为了进一步评估LR宏基因组组装注释新蛋白的能力，本研究选择了三个常用于评估宏基因组鉴定能力的蛋白：视紫质、聚酮合成酶(PKS)和CRISPR系统。

①在LR中鉴定到的视紫红质的数量最多，可以识别三个Tara装配中没有的、新的视紫红质，这表明即使是单一的样本，LR宏基因组也可以组装出新的视紫红质；

②聚酮合成酶分为三类，三个数据集筛选到类型1的数量相似，对于类型3和杂囊性糖脂合成酶PKS，LRa的筛选鉴定能力最强；

③在LR中，发现4个既包含Cas蛋白又包含完整CRISPR阵列的序列。

获得高质量、可靠的MAGs

以培养组作为参考，比较两种方法产生的MAGs的完整性情况，在LRa和SRa中检索到两种微生物基因组。SRa只有2%完整度，有6个小contigs，其中最长的为34 kb；LRa MAG几乎覆盖了整个纯培养获得的基因组，只有6个contigs，最长608 kb，占纯培养株系基因组的98%以上。

总之：LRa比之前的Illumina表现得更好，产生更大的contigs，更容易binning，因此，可以组装复原更多更完整的宏基因组数据来源的基因组，包含许多适应性基因。它可能会补充SAGs和MAGs，以获得在过去十年中发现的许多新群体的完整和可靠的基因组，提高它们的注释效果。

文章链接：

Enhanced Recovery of Microbial Genes and Genomes From a Marine Water Column Using Long-Read Metagenomics.Frontiers in Microbiology.2021

DOI:10.3389/fmicb.2021.708782.