本发明涉及一种消除荧光瑞利散射方法，特别是一种三维荧光中瑞利散射扣除方法。

背景技术：

三维荧光光谱作为指纹图谱和定性定量方法，近年来得到了广泛应用。为了改善谱图质量和更准确定性定量，需要消除掉谱图中夹杂的瑞利散射信号。常用的方法包括：空白扣除法、Delaunay三角形内插值法、置零法和缺损数据重构法(MDR)等。其主要思路有两条，一是如空白扣除法的，从含有瑞利和荧光的混合数据中，消除瑞利数据，保留荧光数据，但是3D荧光测量时较长，采用空白法将使得时间增加一倍，如果只保留一次空白数据，下次再用，又无法保证重复性；二是将瑞利和荧光重叠区域清除后直接作为结果，或者用周围数据拟合出被清除的区域，因而，这种思路在荧光信息较丰富的区域，存在信息量损失较大的风险。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种三维荧光中瑞利散射扣除方法，以解决现有技术存在的上述测量时间长、存在信息量损失较大风险的不足之处。

本发明的技术方案是：一种三维荧光中瑞利散射扣除方法，该方法是先找出与荧光不重叠的瑞利峰，获取瑞利峰数据R，将瑞利峰数据R消除随机误差和噪声后作为单位瑞利峰RD；从瑞利峰与荧光出现交叠的发射光谱开始，逐步消除瑞利峰，直至所有交叠的瑞利散射被消除。

本发明的进一步技术方案是：该方法包括以下步骤：

S1.测量样本的三维荧光光谱；

S2.找出与荧光不重叠的瑞利峰，将含完整的瑞利峰型数据另外存储为R；

S3.取瑞利峰数据R，以中心波长对齐，按峰高归一化后平均，消除随机误差和噪声，作为后续的单位瑞利峰RD；

S4.从瑞利峰与荧光出现交叠的发射光谱开始，逐步消除瑞利峰；

S5.依次对下一波长交叠的发射光谱，直至所有交叠的瑞利散射被消除。

本发明的进一步技术方案是：在步骤S4中，是按照以下瑞利峰扣除步骤进行消除瑞利峰：

S4-1.将单位瑞利峰RD中心波长λ与荧光-瑞利交叠光谱中的瑞利峰中心位对齐；

S4-2.选择交叠光谱附近若干个相邻发射谱，构成比对矩阵M；

S4-3.以单位瑞利峰RD强度为步长Δ，从交叠光谱中扣减Δ，得到扣减后的光谱K；

S4-4.计算光谱K与比对矩阵M的夹角θ；

S4-5.依次增加步长n Δ，n=2,3,…n，重复步骤S4-3和S4-4，直至出现最小夹角值θmin；

S4-6.将交叠光谱减去与最小夹角对应步长强度nΔ的瑞利峰，即完成了瑞利峰的扣除。

本发明的更进一步技术方案是：在步骤S4-2中，所述的选择交叠光谱附近若干个相邻发射谱是选择与中心波长λ处光谱间隔大于等于10nm的4个发射谱。

由于采用上述技术方案，本发明之三维荧光中瑞利散射扣除方法与现有技术相比，具有以下有益效果：

1.可消除三维荧光的瑞利散射

由于：

(1)三维荧光中瑞利散射(包含二级瑞利散射)以峰的形式表现，其峰型一致，由仪器狭缝、单色器性质决定，差异在于中心波长和峰高(强度)不同，因此，只要在荧光响应中找出瑞利峰中心位置和强度，就能加以扣除。

(2)根据荧光性质，在不同激发波长的荧光发射谱上，瑞利峰的位置是不同，而荧光波形保持一致。对应激发波长为A的某个发射谱，在其间隔若干激发波长的相邻发射谱上A波长位置及其附近只有荧光响应，并没有瑞利峰干扰；如果激发波长A的发射谱的瑞利干扰被彻底消除，此谱与临近的激发谱，在波长A附近将具有最高的相似度。根据此性质，以单位瑞利峰作步长扣减，可以判断出扣减的完成情况。

因此，本发明是先找出与荧光不重叠的瑞利峰，获取瑞利峰数据R，将瑞利峰数据R消除随机误差和噪声后作为单位瑞利峰RD；从瑞利峰与荧光出现交叠的发射光谱开始，逐步消除瑞利峰，直至所有交叠的瑞利散射被消除，可获取不受干扰的荧光光谱。

2.节约了测量时间

本发明与空白扣除法相比，不仅可保证重复性，也不需要重复测量空白，从而节约了测量时间。

3.降低了信息量损失的风险

由于本发明覆盖范围在荧光涉及的所有区域，本发明与清除交叠区域的方法相比，大大降低了信息量损失的风险。

4.方法简便，易于推广。

下面，结合附图和实施例对本发明之三维荧光中瑞利散射扣除方法的技术特征作进一步的说明。

附图说明

图1：实施例一中，200-800nm波长范围的EEM三维图，

图2：实施例一中，主体荧光峰的局部图；

图3：实施例一中，636.6nm、617.7nm和598.8nm激发波长对应的发射谱图；

图4：实施例一中，565.8nm、556.4nm和547.0nm激发波长对应的发射谱图；

图5：实施例一中，将瑞利峰按照中心波长对齐、极大值归一化后求取平均值得到的单位瑞利峰图，

图6：实施例一中，扣减步长数和空间夹角值的变化关系图，

图7：实施例一中，分别为556.4nm激发，含有瑞利成分和完全消除瑞利散射的荧光发射谱图，

图8：实施例一中，原始EEM的等高线图，

图9：实施例一中，去除瑞利散射的等高线图。

在上述附图中：

λ1-636.6nm激发波长对应的发射谱，

λ2-617.7nm激发波长对应的发射谱，

λ3- 598.8nm激发波长对应的发射谱，

λ4-565.8nm激发波长对应的发射谱图，

λ5-556.4nm激发波长对应的发射谱图，

λ6- 547.0nm激发波长对应的发射谱图，

P1-含有瑞利成分的荧光发射谱，

P0-完全消除瑞利散射的荧光发射谱。

具体实施方式

一种三维荧光中瑞利散射扣除方法，该方法是先找出与荧光不重叠的瑞利峰，获取瑞利峰数据R，将瑞利峰数据R消除随机误差和噪声后作为单位瑞利峰RD；从瑞利峰与荧光出现交叠的发射光谱开始，逐步消除瑞利峰，直至所有交叠的瑞利散射被消除。该方法包括以下步骤：

S1.测量样本的三维荧光光谱；

S2.找出与荧光不重叠的瑞利峰，将含完整的瑞利峰数据另外存储为R；

S3.取瑞利峰数据R，以中心波长对齐，按峰高归一化后平均，消除随机误差和噪声，作为后续的单位瑞利峰RD；

S4.从瑞利峰与荧光出现交叠的发射光谱开始，逐步消除瑞利峰；

S5.依次对下一波长交叠的发射光谱，直至所有交叠的瑞利散射被消除。

在步骤S4中，是按照以下瑞利峰扣除步骤进行消除瑞利峰：

S4-1.将单位瑞利峰RD中心波长λ与荧光-瑞利交叠光谱中的瑞利峰中心位对齐；

S4-2.选择交叠光谱附近若干个相邻发射谱，即选择与中心波长λ处光谱间隔大于等于10nm的4个发射谱，构成比对矩阵M；

S4-3.以单位瑞利峰RD强度为步长Δ，从交叠光谱中扣减Δ，得到扣减后的光谱K；

S4-4.计算光谱K与比对矩阵M的夹角θ；

S4-5.依次增加步长n Δ，n=2,3,…n，重复步骤S4-3和S4-4，直至出现最小夹角值θmin；

S4-6.将交叠光谱减去与最小夹角对应步长强度nΔ的瑞利峰，即完成了瑞利峰的扣除。

实施例一：

本发明选用罗丹明B的三维荧光中瑞利散射扣除方法作为实施例一，该方法包括以下步骤：

S1.测量样本的三维荧光光谱

图1是200-800nm波长范围的EEM三维图，图2是主体荧光峰的局部图；

图3中分别是636.6nm、617.7nm和598.8nm激发波长对应的发射谱；大部分瑞利峰与荧光不存在交叠，可以直接擦除；只需对瑞利峰与荧光存在交叠部分激发光谱加以处理。

对于瑞利峰和荧光峰重叠严重的，如图4，采用直接扣除和插值法都存在困难，接下来以556.4nm激发的荧光发射谱为例，扣除其中的瑞利峰成分。

S2.找出与荧光不重叠的瑞利峰，将含完整的瑞利峰型数据另外存储为R。

S3.取瑞利峰数据R，以中心波长对齐，按峰高(极大值)归一化，然后求取多个峰的平均值，作为后续的单位瑞利峰RD，用于下一步的扣除，如图5。

S4.从瑞利峰与荧光出现交叠的发射光谱开始，按照以下瑞利峰扣除步骤进行消除瑞利峰：

S4-1.将图5中的单位瑞利峰RD中心波长λ与556.4nm光谱的瑞利峰中心位对齐；

S4-2.选择与该556.4nm光谱间隔大于等于10nm的4个发射谱，即对应556.4nm，选择EEM中547.0nm和542.4nm、565.8nm和570.5nm，构成比对矩阵M。

S4-3.以单位瑞利峰RD强度为步长Δ，从交叠光谱中扣减Δ，得到扣减后的光谱K；

S4-4.计算光谱K与比对矩阵M的夹角θ；

S4-5.依次增加步长n Δ(n=2,3,…n)，重复步骤S4-3和S4-4，直至出现最小夹角值θmin；该最小夹角值对应的步长，即为交叠光谱中瑞利峰的强度。图6是扣减步长数和空间夹角值的变化关系，最小值出现在385步，即此时交叠光谱中的瑞利成分被完全扣除。

S4-6.将交叠光谱减去与最小夹角对应步长强度nΔ的瑞利峰，即完成了瑞利峰的扣除。图7中分别为556.4nm激发，含有瑞利成分和完全消除瑞利散射的荧光发射谱。

S5.依次将各个交叠光谱中的瑞利峰扣除，实现完整的EEM中的瑞利消除。图8为原始EEM的等高线图，图9为去除瑞利散射的等高线图。