文献翻译：Comparative metagenomics of hydrocarbon and methane seeps of the Gulf of Mexico

Comparative metagenomics of hydrocarbon and methane seeps of the Gulf of Mexico

摘要
背景
结果
- 墨西哥湾沉积物的地球化学特征
- 墨西哥湾沉积物中的微生物丰度
- 墨西哥湾沉积物中的微生物群落组成
- 墨西哥湾沉积物的比较宏基因组分析
讨论
- 无活性烃渗漏迹象的沉积物
- 碳氢化合物渗漏与甲烷渗漏
方法
- 样品说明
- 定量聚合酶链反应（qPCR）分析
- Illumina Miseq扩增文库的制备、测序和分析
- 宏基因组文库的制备、测序与分析
- 统计分析

https://www.nature.com/articles/s41598-017-16375-5

摘要

石油和天然气在墨西哥湾沉积物中大量渗透，导致海底大量渗漏，复杂的微生物群落，有时还有动物群落繁衍生息。
对墨西哥湾三个地区的沉积物进行了调查和比较，其中两个地区的冷泉具有不同的碳氢化合物组成，一个地区位于任何活跃渗漏区域之外。
与渗漏微生物组的存在相一致，与活动渗漏区外部的沉积物相比，在渗漏区观察到明显的微生物群落。
沉积物中的微生物群落在不受油气渗漏影响的情况下，以平核菌为特征，其代谢潜力与碎屑海雪降解一致。
相比之下，在以甲烷为主要烃源的渗漏样品中，甲烷被丰富的ANME-1分子氧化可能是主要的过程。
以同时含有甲烷和复杂碳氢化合物的流体为特征的渗漏样品具有丰富的氯曲菌（厌氧菌科）和deltaproteobacteric谱系，并显示出复杂碳氢化合物降解的潜力。
这些不同的代谢能力表明，冷泉中的微生物可能依赖于甲烷氧化以外的其他过程，而渗滤液中的烃类成分可能是构成海底微生物群落组成和功能的关键因素。

背景

墨西哥湾沉积物中蕴藏着大量甲烷和其他碳氢化合物的浅层来源。
其中包括甲烷渗漏1、2、碳氢化合物渗漏3、4、5、天然气水合物丘6、7、8、地下卤水9、沥青10、11、12和泥火山13。
根据流体流速和硫化氢浓度的不同，这些渗漏维持着明显的微生物群落，这些微生物群落可通过白色或有色的微生物垫、泡状肌蛤和/或管蠕虫的聚集体来识别14。
许多研究集中在这些环境中存在的微生物群落上，并且观察到大量依赖甲烷和硫循环的微生物多样性15。

特别关注的是古细菌厌氧甲烷转化菌（ANME）和硫酸盐还原菌（SRB）的联合体，它们将甲烷的厌氧氧化与硫酸盐还原结合起来15。
尽管厌氧甲烷氧化（AOM）的机制自2000年16起就已被研究，似乎涉及一种逆产甲烷途径17、18、19，但确切的过程仍不清楚，根据涉及的物种可能会出现不同的变体18、20。
事实上，不同的ANME（ANME-1a、-b、ANME-1Guaymas、ANME-2a、-2b、-2c、ANME-3、ANME-2d/GoM Arc I/AAA）15、21、22、23与甲烷单胞菌和甲烷单胞菌密切相关。
此外，在这些环境和其他环境中的同营养甲烷氧化联合体中还发现了硫酸盐还原的Deltaproteobacteria（Desulfoscarcina/Desulfoccus组的SEEP SRB1a、SEEP SRB2、Desulforvidus谱系和Desulfobulbus属的一些成员）。
然而，ANME-1和ANME-3被观察到是单特异性的聚集体，质疑ANME古菌和硫酸盐还原的deltaprotobacteria之间的联系是否是专一的21,22,29。
由于ANME序列在16srrna基因检测中的普遍存在，以及ANME和SRB30显著聚集体的显微检测，AOM被广泛认为是冷泉沉积物中发生的主要过程。
因此，参与AOM的微生物联合体一直是海洋渗漏沉积物微生物研究的焦点。

尽管许多未培养的古细菌和细菌谱系与ANME/SRB联合体共同存在，但这些环境中的微生物群落的其他成员还是多少被忽视了14。
非ANME/SRB谱系的相对比例随着与渗漏源的距离和动物群的接近而增加，这表明这些渗漏沉积物中存在除AOM以外的生态位。
此外，通过选择非甲烷碳氢化合物降解物、产甲烷菌和醋酸菌11，渗滤液中石油和高级碳氢化合物的存在也被怀疑在形成现有微生物群落方面发挥了重要作用。
事实上，墨西哥湾渗漏的活性测量表明，非甲烷碳氢化合物的降解显著支持了硫酸盐的还原速率，并且未培养的三角洲蛋白细菌群可能负责降解高分子量的碳氢化合物11。
在硫酸盐还原菌31中检测到与烷烃厌氧降解有关的基因，从渗漏沉淀物中成功培养出烃降解硫酸盐还原剂32,33，以及稳定同位素探测实验34证实了这一点。
此外，单细胞基因组学和大型宏基因组数据集基因组箱的组装，突出了海洋沉积物中一些微生物“暗物质”的代谢潜力。
这些方法揭示了海洋底栖D类群古细菌、深海古细菌、中庭细菌和脱卤孢子虫对有机物的降解能力，以及深海古细菌产甲烷的潜力35、36、37、38、39。
然而，以基因组为中心的宏基因组学只提供了谜团的一部分，海洋深海生态系统中微生物群落功能的整体图景仍然支离破碎。

为了更好地了解海洋渗漏生态系统中的群落结构和不同功能，对墨西哥湾密西西比峡谷三个地区的样本采用了比较多基因和元基因组测序方法。
密西西比峡谷有许多浅层甲烷和产热气体水合物的海底丘40。比较了两个具有不同烃类成分的冷泉点，它们可能反映甲烷和产热气体水合物，以及任何活跃渗漏区域以外的样品。
确定了微生物群落的共同和独特的代谢特征，并辅以地球化学数据，以提供对海洋碳氢化合物渗漏环境中不同微生物过程的新见解。

结果

墨西哥湾沉积物的地球化学特征

2015年10月，在墨西哥湾密西西比峡谷的三个不同位置采集了推芯沉积物样品。
场地1（PC5和PC6）和场地2（PC9和PC10）位于70米远的位置，提供了沉积物表面渗流和白色席状痕迹的明确地球化学证据。
在距离任何可见活动渗漏区域较远的位置，也取了两个推挤岩芯（PC11和PC12）作为“背景”参考样品。
在这些沉积岩芯中观察到不同的孔隙水成分（表1）。
在所有样品中硝酸盐低于检出限（<0.08 mM）。
相对于海水，现场1（PC5和PC6）的渗出和现场2PC10的核心的硫酸盐部分耗尽。
在PC10内核中，7.88 毫米和12.93 mM硫酸盐分别出现在3–4 cmbf和10–12 cmbsf处，而硫酸盐浓度随深度的增加而降低，从1号位置到13号位置 3–4 cmbsf下的mM硫酸盐降至5.3 PC5中11–12 cmbsf处的毫米（表1）。
相比之下，渗漏区外的沉积物岩芯（PC11和PC12）以及场地2的PC9呈现出相反的对比剖面，硫酸盐消耗量为3–4 cmbsf（10 mM硫酸盐）和海水硫酸盐浓度（27 mM）在10–12 cmbsf。
此外，除PC9（表1）外，所有渗漏点的岩芯中均检测到硫代硫酸盐。
总体而言，在甲烷浓度低于0.05的沉积物样品中检测到低甲烷浓度 µ渗漏区以外的所有沉积物样品以及PC9中的M。
浓度为2.55µM的甲烷和169 µ在PC10（位点2）和PC5（位点1）的底部分别检测到M（表1）。
此外，对现场1推覆岩芯（PC5和PC6）沉积物的GC分析表明，存在未溶解的碳氢化合物与各种芳香化合物和霍帕烷类化合物的复杂混合物（UCM）（表1），如之前在密西西比峡谷40的天然气水合物中观察到的。
甲烷是在2号场地（PC9和PC10）沉积物中检测到的唯一碳氢化合物。

Table 1 Geochemical description and microbial abundance of the samples. UCM: Uncharacterized complex mixture. ND: Not Determined.

墨西哥湾沉积物中的微生物丰度

使用定量PCR估计的微生物丰度在墨西哥湾渗漏和非渗漏地点的沉积物中不同（表1）。
在渗漏区以外的沉积物（PC12和PC11）中，16srrna基因丰度（细菌+古细菌）为1.5 ± 0.6 × 108个16srrna每克整个沉积物岩芯。
在这些沉积物中，细菌16srrna基因占总16srrna基因丰度的82%，占1.25% ± 0.6 × 108个16srrna每克在1号站位沉积物（PC5和PC6）中，16srrna基因总丰度是非渗漏沉积物的10倍，平均为9.7 ± 2.1 × 108个16srrna每克在PC5的3–4 cmbsf沉积层和整个PC6中有1个。
PC5底部（10-12cmbsf）沉积层微生物丰度增加，其中含3.13 × 109个16srrna每克在PC5和PC6沉积岩芯中，细菌在3–4 cmbsf沉积层中占优势（占16S rRNA基因丰度的85%），而在10–12 cmbsf沉积层中检测到相似数量的细菌和古菌。
在场地2沉积物（PC9和PC10）中，微生物丰度是不均匀的，可能是由于局部渗漏造成的。
在PC9沉积岩芯中，3.6 × 108个16srrna基因−细菌基因占16srrna基因丰度的80%。
相比之下，超过1.3 × 109个16srrna基因−在PC10沉积物中检测到1个古细菌基因，分别占原核生物16srrna基因总数的52%和57%。

墨西哥湾沉积物中的微生物群落组成

通过16srrna基因测序，墨西哥湾沉积物的微生物群落组成平均为9.41 ± 5 × 104 reads per sample。
古细菌和细菌序列分析都表明样本具有相似的聚类（图1a和c）。
渗漏区外的沉积物样品（PC11和PC12）呈现出不同于渗漏群落的群落组成（One-Way NPMANOVA F:23.66p:0.0023, SIMPER average dissimilarity: 49.5），PC9沉积物岩芯的地球化学和微生物丰度剖面与渗漏区外的沉积物相似（表1）。
排除PC9样本，对古细菌16S rRNA基因数据集的SIMPER分析表明，海洋底栖动物E群（45 ± 4%的古菌读数在3–4 cmbsf（PC11和PC12）和海洋菌群I在非渗漏样品中占优势（44 ± 5%的古细菌在PC11和PC12中的读数为10–12 cmbsf），并解释了渗漏沉积物中的古细菌群落组成与外部渗漏区域沉积物之间的差异（图1b）。
同样，对细菌16srrna基因数据集的SIMPER分析表明，在非渗漏样品中，扁平菌的成员占优势（28） ± 3%的细菌读取整个PC11和PC12），并解释了渗漏样品与渗漏区外样品之间的19%的差异。
渗漏样品的古细菌群落以海洋底栖类群D（55）成员为主 ± 7%的序列，30%的差异性；模拟）和ANME-1在10–12 cmbsf（8 ± 2%的序列，4%的差异性；（图1b）。
渗漏样品中的细菌群落与渗漏区以外的样品形成对比，因为存在几个三角杆菌谱系，尤其是与共营养菌科密切相关的渗漏SRB2群（14 ± 4%的细菌16S rRNA基因序列在PC10中读取，在PC5和PC6中在10–12 cmbsf处读取），并且SEEP SRB1b隶属于脱硫肉瘤/脱硫球菌组（脱硫杆菌科）（图1d）。
候选组JS1（心房细菌）相关序列也仅在渗漏沉积物样品中鉴定。JS1序列代表了10–12 cmbsf（9 ± 4%的细菌16srrna基因在PC10、PC5和PC6中以10–12 cmbsf的频率读取。
此外，还观察到渗漏样品（PC10与PC5和PC6）之间的差异。氯仿比例较大（28 ± 4%的序列，20%的差异性；SIMPER）在1号点（PC5和PC6）检测到，而SEEP SRB1b和SEEP SRB2相关序列的比例较大（15 ± 3和12.5 ± 序列差异性分别为18%和11%；在PC10中观察到SIMPER（图1d）。

图1
16S rRNA gene amplicons analysis. (a) Bray-Curtis similarity clustering of the samples based on (b) archaeal 16S rRNA gene sequences (OTU at 97% similarity). © Bray-Curtis similarity clustering of the sample based on (d) bacterial 16S rRNA gene sequences (OTU at 97% similarity). Samples not associated with active seeps (PC11 and PC12) are labeled with brown dots, Site1 oil seep samples (PC5 and PC6) with green dots and Site2 oil seep samples (PC9 and PC10) with yellow dots.
16srrna基因扩增子分析(a）样本的Bray-Curtis相似性聚类基于（b）古细菌16srrna基因序列（OTU相似性为97%）(c）基于（d）细菌16srrna基因序列的样本Bray-Curtis相似性聚类（OTU相似性为97%）。与活动渗漏无关的样品（PC11和PC12）用棕色点标记，Site1油渗漏样品（PC5和PC6）用绿色点标记，Site2油渗漏样品（PC9和PC10）用黄色点标记。

还通过甲基辅酶M还原酶α亚基基因（mcrA）和异化亚硫酸盐还原酶（dsrAB）基因的高通量测序研究了产甲烷菌/厌氧甲烷转化菌和硫酸盐还原菌的群落组成（补充图1）。在渗漏活跃区域以外的沉积物中未检测到产甲烷菌或ANME，而在所有渗漏样品中检测到ANME1和ANME2相关mcrA基因以及各种产甲烷菌相关序列（补充图1b）。所有样品中均检出硫酸盐还原菌。脱硫菌科成员的大量读数（62 ± 在PC10沉积物样品中检测到4%的dsrAB读数，而在联营养杆菌科（28 ± 6%的dsrAB序列）在外部渗漏区的样品中被鉴定（补充图1d）。脱硫菌属（脱硫杆菌科）相关序列（13） ± 9%的dsrAB序列）在渗漏样品中的相对丰度也较高（补充图1d）。此外，在所有样本中检测到的序列中有相当一部分与Muller等人（2015）定义的环境聚类9、10和13有关，这些聚类缺乏任何已知的培养代表（补充图1d）。

墨西哥湾沉积物的比较宏基因组分析

考虑到PC5和PC6以及PC11和PC12之间的高度相似性，分别对代表渗漏点1和非渗漏区的PC5和PC12的渗漏沉积物样品进行了元基因组分析。
PC10沉积物岩芯被选为渗漏点2的代表，因为PC9表现出与渗漏区外沉积物相似的地球化学和微生物丰度剖面。
对6个沉积物样品（来自PC5、PC10和PC12的3-4和10-12 cmbsf沉积物层）进行了鸟枪式宏基因组测序。
尽管使用Metabat41和GroopM42进行了多次尝试，但草案基因组的宏基因组组合还是没有成功。
这可能是由于序列的高度可变性加上有限的测序深度，这使得组装具有挑战性43。
因此，我们的宏基因组分析侧重于比较三个位点之间的阅读分布。

从亚基因组中提取16srrna基因序列。
不同微生物群的相对比例与qPCR的估计相似，渗漏区外沉积物中90%的16S rRNA读数与细菌有关，而渗漏点2（PC10）的16S rRNA基因读数与古细菌有关（图2）。
虽然，细菌16srrna阅读的分类隶属关系与16srrna基因扩增文库一致（相关分析） = 0.86，p < 0.01），通过鸟枪宏基因组学获得的古细菌多样性呈现出不同的图像，尤其是对于PC10样品（相关系数r = 0.14，p = 0.05).
在元基因组数据中，ANME-1（古细菌厌氧甲烷转化菌） 16S rRNA基因分别占PC10和PC5沉积物中古菌16S rRNA读数的80%和14%（图2）。
与基于扩增子的分析中较低的ANME-1相对丰度相比（<10%；图1b）。
这种差异可能是由于引物的选择性，因为从亚基因组回收的ANME-1 16srrna基因序列与扩增子分析中使用的引物有3个不匹配。
因此，通过16S rRNA基因扩增子分析（图1b）检测到的作为古细菌群落主要古细菌成员的MBGD成员和热浆菌的相对比例分别不到从PC10和PC5元基因组数据中恢复的读数的5%和10%。

图2
Relative proportion and affiliation of 16S rRNA genes recovered from shotun metagenomes in (a) 3–4 cmbsf and (b) 10–12 cmbsf sediment layers of PC12 (non seep sample); © 3–4 cmbsf and (d) 10–12 cmbsf sediment layers of PC10 (Site 2 methane seep); (e)3–4 cmbsf and (f) 10–12 cmbsf sediment layers of PC5 (Site 1 oil seep).
shotun亚基因组中16srrna基因的相对比例和亲缘关系（a）3-4cmbsf和（b）10-12cmbsf PC12沉积层（非渗漏样品）(c） 3–4 cmbsf和（d）10–12 cmbsf PC10沉积层（场地2甲烷渗漏）(e） 3–4 cmbsf和（f）10–12 cmbsf PC5沉积层（现场1渗油）。

在3–4和10–12 cmbsf样本之间，未观察到代谢潜能的显著差异（图2；总元基因组：3–4和10–12 cmbsf之间的Bray-Curtis相似性 > 90%），表明每个沉积物核心具有保守的代谢能力。
因此，在宏基因组比较分析中，来自3–4和10–12 cmbsf沉积物层的宏基因组被视为每个岩芯的代表性。
三个沉积物岩芯的元基因组分析确定的代谢潜力的三元图突出了三个位点之间不同的代谢能力（图3）。
渗漏区外样本（PC12）的微生物群落中，与氮循环（narGH、hao）、氯化物降解（clrAB、exaA、adhC）、磺化杂多糖降解（aslA、arsAB、gns、galns、betC、ids）和其他多糖和糖降解（neu、fucA、srfJ）有关的基因过多，uidA）。
根据这些基因的分类特征，氮循环基因（25%的narG读数和95%的hao读数）主要与海洋平核菌（Candidatus Scalindua）相关（van de Vossenberg et al.，2013），然而，磺化化合物和多糖的初始分解的遗传潜力在扁平菌（31%）、拟杆菌（31%）和厚壁菌（13%）中被确定（图4）。
相比之下，在以甲烷为主的场地2渗漏样品PC10的沉积物岩芯中检测到固氮（nifBEFHK）和厌氧甲烷氧化途径（mcrABCG、mtrEC、mfnADF、fmdABC）的高代表性（占所有基因的70–80%）（图3）。
固氮基因主要隶属于厚壁菌（45%）、ANME-1（30%）和脱硫菌科（24%），而参与AOM的基因主要隶属于ANME-1谱系（47%）（图4）。
同样，参与碳氢化合物降解的各种基因（bssA、bssEF、bnsE、hyaAB、badDI、aliB）以及来自硫酸盐还原途径（dsrB、aprA）的基因在含有更复杂碳氢化合物的渗漏点1（PC5）的沉积物样品中过度表达（图3）。
硫酸盐还原基因主要隶属于Deltaproteobacteria（57%）和Firmicutes（17%）。碳氢化合物降解基因的分类学联系表明，在Deltaproteobacteria（脱硫杆菌科（45%）和联营养杆菌科（47%）中甲苯降解（bssA），在放线杆菌中环己烷降解（23%），厚壁菌（34%），α-（14%）和Deltaproteobacteria（脱硫杆菌科22%）以及Deltaproteobacteria（脱硫杆菌科27%）和Chloroflexi（72%）中的多环芳烃降解（bnsE）（图4）。

图3
Ternary plot of genes identified in PC12 (non seep, brown corner), PC10 (Site 2 methane seep, yellow corner) and PC5 (Site 1 oil seep, green corner) sediment cores. Each dot represents a single gene. 1795 genes were represented, corresponding to the genes with the most differential representation between the sediment cores and together explaining 80% of the dissimilarity between metagenomes after normalization. The colors of the dots correspond to specific metabolic pathways. The closer the symbol is to the node of the triplot, the more predominant the gene is in that particular sediment site compared to the others. Genes in the center are shared among all three sites. Owing to the large number of shared genes between studied sites only genes overrepresented in one sample (more than 50% of all the genes found in 3 cores are found in one specific core) were investigated. In addition, specific pathways were also analyzed. A list of identified genes with a description and KEGG orthology is provided in Supplementary Table 3.
在PC12（非渗漏，棕色角）、PC10（第2位甲烷渗漏，黄色角）和PC5（第1位石油渗漏，绿色角）沉积岩芯中鉴定的基因的三元图。
每个点代表一个基因。
1795个基因被代表，对应于沉积物核心之间差异最大的基因，共同解释了标准化后亚基因组之间80%的差异性。
点的颜色对应于特定的代谢途径。
符号越接近三胞胎的节，与其他基因相比，该基因在特定沉积部位的优势就越大。
中心的基因在这三个位点上是共享的。由于研究地点之间有大量的共享基因，因此只调查了在一个样本中过度表达的基因（在3个核心中发现的所有基因中有50%以上是在一个特定的核心中发现的）。
此外，还分析了具体途径。在补充表3中提供了一个带有描述和KEGG正畸学的已鉴定基因的列表。

图4
Relative proportion and taxonomic affiliation of specific genes in each normalized metagenome for selected metabolic processes. (a) Nitrate reduction (narG); (b) Nitrification (hao); © Nitrogen fixation (nifK); (d) Methanogenesis/anaerobic oxidation of methane (mcrA); (e) Sulfate reduction (dsrB); (f) Sulfide oxidation (SoxB); (g) Hydrocarbon degradation (bssA); (h) Hydrocarbon degradation (aliB); (i) Hydrocarbon degradation (bnsE); (j) sulfatase (aslA); (k) Glycan degradation (fuca).
所选代谢过程中每个标准化元基因组中特定基因的相对比例和分类隶属关系(a）硝酸盐还原（narG）(b）硝化作用（hao）(c）固氮（nifK）(d）产甲烷/甲烷厌氧氧化（mcrA）(e）硫酸盐还原（dsrB）(f）硫化物氧化（SoxB）(g）烃类降解（bssA）(h）烃类降解（aliB）(i）烃类降解（bnsE）(j）硫酸酯酶（aslA）(k）聚糖降解（fuca）。

讨论

墨西哥湾的沉积速率很高（1–10 mm.y−1）这种有机质在地质时间尺度上的积累、埋藏和成熟，已经产生了广泛的天然碳氢化合物渗漏环境，如冷泉、天然气水合物、卤水和沥青火山44。
对采样渗漏区的地球化学分析表明，渗漏流体的组成不同。
在现场1（PC5和PC6）中，在沉积物中检测到甲烷和更复杂的碳氢化合物（UCM、芳香族化合物和霍帕烷族化合物），如之前在产热天然气水合物和密西西比峡谷渗漏40中所观察到的，而甲烷是现场2沉积物中发现的唯一碳氢化合物，这与在峡谷40中观察到的甲烷水合物和渗漏相一致。
因此，在这项研究中，比较了墨西哥湾三种不同环境中的微生物群落组成和代谢潜力：甲烷渗漏（PC9和PC10）、碳氢化合物渗漏（PC5和PC6）和渗漏区以外的沉积物（PC11和PC12）。
在所有样品中，通过反向三羧酸循环和木材永达尔途径固定二氧化碳的可能性以及发酵（甲酸盐和乙酸盐）的可能性都得到了高度体现（图3）。
这与深海沉积物中有机营养和化学合成生活方式的优势是一致的。

无活性烃渗漏迹象的沉积物

尽管非渗漏区域代表了所有海洋沉积物的绝大多数，但与渗漏沉积物相比，它们的调查仍然相对较少。甲烷浓度极低（<0.05） µM）在非渗漏沉积物中进行了分析。此外，在亚基因组和靶向扩增中均未检测到mcrA基因。这与地球化学数据一致，表明这些采样点不受烃类渗漏的影响。16S rRNA基因分析（基于扩增子和宏基因组）表明了一个特定的群落组成，如之前在Guaymas盆地海底沉积物中观察到的那样，平核菌、海洋I群和海洋底栖E群古菌的比例过高，而碳氢化合物渗漏的影响最小14,22。对亚基因组的比较分析表明，几个代谢基因的过度表达，尤其是与扁核菌和拟杆菌有关，这些基因参与各种聚糖以及氯化和磺化化合物的降解，如之前由fosmids序列45检测到的。在海洋环境中，氯甲烷和其他氯代烷烃等氯代化合物来自浮游植物和藻类（Gribble，2003），而磺化化合物被发现是腐殖酸和藻类（琼脂和岩藻聚糖）的主要成分46。同样，聚糖是海洋无脊椎动物组织和藻类中丰富的多糖45。因此，非渗漏地点的群落很可能适应以海洋雪和腐烂的有机物颗粒形式输送到沉积物中的碎屑有机物的生长。正如先前观察到的22，不可能从非渗漏沉积物中提取足够质量或数量的RNA进行后续分析（数据未显示）。这一观察结果，以及在水柱47和/或附着在宏观碎屑团聚体48上的海洋I类古细菌和扁平菌的频繁发现，表明这些微生物可能主要具有远洋生活方式，降解海洋雪中的杂多糖，主要代表沉积在沉积物中的生物和水柱衍生的有机质，在这些海洋沉积物中原位活动有限。从narG基因推断的硝酸盐还原潜力在扁平菌、候选菌OP3、真核菌和变形菌中检测到。然而，这些细菌和古菌的代谢活性可能由于硝酸盐（在所有沉积物样品中低于检出限）和亚硝酸盐的低可用性而在海洋沉积物中受到限制。硫酸盐还原剂是通过靶向扩增（16srrna和dsrAB基因）检测到的，但在shotgun元基因组数据中有少数的读数，硫酸盐仅在上层沉积物中耗尽。如果硫酸盐还原不能通过磺化有机化合物产生硫酸盐的巨大潜力（在元基因组数据中发现了大量的硫酸酯酶基因）或沉积物中检测到的α-和γ-变形杆菌的硫化物氧化来平衡，这些结果表明，在这些沉积物中检测到的硫酸盐还原剂的活性是有限的。
因此，非渗漏沉积物中的生态系统很可能主要是由利用水柱衍生的有机碳驱动的，这不足以支持海水衍生硫酸盐的完全还原。
由此推论，硫酸盐还原不受上升流的有机碳来源的支持，这与这些沉积物中缺乏烃类渗漏的证据相一致。
在这些沉积物中检测到10–12 cmbsf海水水平的硫酸盐表明，表层沉积物硫酸盐还原群落可能在某种程度上通过海水平流进入沉积物，但即使如此，从水柱输送到沉积物的有机物，不足以支持硫酸盐完全还原。

碳氢化合物渗漏与甲烷渗漏

冷渗漏是指甲烷和其他碳氢化合物从地下海床向上平流到海底49。先前对从海底生态系统中回收的16S rRNA基因进行的全球分析确定了冷泉环境中的一个特定微生物组30，然而，甲烷和油泉微生物群落和代谢特征之间的区别受到的关注要少得多11。多基因（16srrna、dsrAB和mcrA基因）和元基因组测序强调了甲烷和石油渗漏之间的微生物群落组成在质量上相似。古细菌（ANME-1、ANME-2、MBGD和热胞浆菌）和细菌（脱硫杆菌科、联营养杆菌科、氯曲菌属、候选科JS1）谱系如之前在墨西哥湾冷泉沉淀物5,11中所述，支持特征性渗漏微生物组30的概念。然而，鸟枪宏基因组测序强调了这些谱系的不同相对比例取决于渗出液的性质。正如先前观察到的11，在甲烷渗漏沉积物中检测到很大比例的ANME-1（高达总16S rRNA读数的37%）。根据这一观察结果，先前在ANME-150中发现的完整的厌氧甲烷氧化途径（不含mer基因的反向产甲烷）在这些沉积物的亚基因组中的比例过高（图3），表明厌氧甲烷氧化具有相当大的潜力。ANME-1相对丰度与SRB1B（r = 0.94便士 = 0.004）和渗漏SRB2（r = 0.89，P = 0.01），与其他缺氧冷泉沉淀物30的结果一致。然而，这些SRB不是ANME-1在冷沉积物中厌氧氧化甲烷的直接共营养伙伴。此外，ANME-1 16S rRNA基因在元基因组数据集中的表达（PC5和PC10中分别为14%和80%）与任何潜在的共营养细菌不相称（0.8%的16S rRNA读数与SEEP SRB1a或Desulfobulbus相关）。因此，这些结果可能表明，我们的甲烷渗漏沉积物中的ANME-1很可能通过与细菌共生无关的反向产甲烷途径氧化甲烷，如先前提出的50,51。富含甲烷的渗滤液中ANME-1的特别丰度表明，厌氧甲烷氧化是这些渗滤液中主要的微生物过程。

相比之下，在烃渗漏沉积物中发现了较大比例的脱硫杆菌科、合营养杆菌科、脱硫素和氯代灵，在这些沉积物中观察到残余油和芳烃。芳烃厌氧降解的基因标记（bssA、aliB、badI、bbsE）在这些沉积物中的表达过多，表明在甲烷和其他碳氢化合物共存的情况下，微生物群落的代谢潜力可能基于更复杂碳氢化合物的分解，而非甲烷氧化。碳氢化合物降解基因主要隶属于脱硫杆菌科和联营养杆菌科的成员，如先前通过对冷泉沉积物的masD/assA/bssA扩增子调查所观察到的31。Desufatiglans的16S rRNA基因与已知可降解烷基取代和未取代芳香烃32的栽培物种相关，以及脱硫杆菌科的其他亚群（SEEP SRB1d）在受甲烷以外碳氢化合物渗漏影响的沉积物样品中的表达过高。因此，这些未培养的Deltaproteobacteria很可能会降解芳香烃，如之前所述26,34，并有助于在这些沉积物中检测到具有生物降解石油特征的UCM。在这些样品中观察到来自脱硫菌科的硫酸盐还原基因（aprA，dsrB）的过度表达，以及孔隙水硫酸盐的耗尽，与其他油渗漏52一样。因此，硫酸盐还原可能为海洋渗漏中的碳氢化合物降解提供能量，这支持了墨西哥湾渗漏沉积物中先前的活性测量，表明硫酸盐还原活性是由非甲烷碳氢化合物11,52推动的。
硫化物氧化基因（Sox）的过度表达，来自已知的垫形成γ-和epsilonprotobacteria（Beggiatoa和Sulfurovum spp.），在这些沉积物的元基因组数据中也很明显（图4），表明微生物垫的形成也可能依赖于这些烃降解硫酸盐还原剂。
虽然在16srrna和dsrAB基因调查中，厚壁菌属（梭状芽孢杆菌）的芳香烃降解和硫酸盐还原相关基因也在宏基因组数据集中被检测到，但它们在16srrna和dsrAB基因调查中只占少数。
厚壁菌门的成员，如梭状芽孢杆菌和脱硫菌，是已知的石油降解菌33，因此它们也可能有助于这些渗漏沉积物中碳氢化合物的降解。此外，多环芳烃（萘）降解（bnsE）的潜力也被确定在氯屈曲门的成员。
氯屈曲经常在海洋沉淀物中检测到39,53，并与许多代谢过程（脱氯54、脂肪酸降解39、芳香族化合物降解和硫酸盐还原55）有关，这取决于氯屈曲谱系。
对从宏基因组数据（数据未显示）重建的全长16S rRNA序列的BLAST分析表明，Chloroflexi序列隶属于厌氧菌科，与先前从泥火山中扩增的Chloroflexi序列密切相关56。
厌氧菌科已被鉴定为厌氧烃降解富集物的丰富组分57、58、59。总的来说，这表明氯曲藻门内发生了相当大的代谢变异，一些与冷泉相关的厌氧菌科谱系可能是迄今未知的芳香烃降解物。
与GC分析检测到的UCM一致，常驻微生物群落的代谢潜力似乎与渗漏的组成相适应，存在不同的降解芳烃的分解代谢途径。

由于渗漏环境的普遍存在，墨西哥湾沉积物为观察渗漏油气组成对微生物群落结构和功能的影响提供了一个独特的机会。尽管这里的微生物群落分析支持特征性渗出微生物组的概念，但我们的取样策略和比较的宏基因组方法表明，不同的微生物群落和代谢特征取决于渗出液的组成。因此，即使这些代谢能力仍有待更大规模的调查、活性测定或转录组学分析来证实，它们也表明，海底生态系统可以通过不同的微生物活动来维持，这取决于渗滤液的组成。

方法

样品说明

2015年10月，使用遥控潜水器在墨西哥湾密西西比峡谷的三个不同位置采集了沉积物推进岩芯样品。重复的推核取了大约20个每个取样点相距60厘米。1号场地（PC5和6）水深1055米，被一层薄薄的微生物席覆盖，有明确的渗漏地球化学证据。地点2（PC9和10）距离约70米，水深1129米，沉积物表面有分散的白色席状痕迹。场地2通过海底声反射率进行识别，但在海底未观察到流体发射。最后，在距离任何可见活动渗流区（1128米水深）200米远的位置取两个沉积物推送岩芯（PC11和12）作为“背景”参考样品。

沉积物岩芯被回收到研究船上，并立即进行无菌切片。海底以下1–3、5–10和12–15厘米的沉积层（cmbsf）被重新取样进行油气分析，而3–4和10–12 cmbsf的样品被重新取样进行微生物和孔隙水分析。微生物样品立即储存在50 ml无菌试管−80 °直到可以提取核酸。如前所述，从5克沉积物中提取核酸（DNA和RNA）60，再悬浮在200克沉积物中 µl的DNA-，RNA-，RNase-自由水。使用Wizard DNA净化试剂盒（Promega，Madison，WI，USA）纯化提取的核酸，并储存在−20 °C直到进一步分析。在核酸提取过程中，PC5和PC6的11–12 cmbsf样品中存在可见油。

用气相色谱法和GC-MSxMS（日本京都岛津）测定了沉积物样品中的甲烷浓度和烃类组成。核酸提取后，离心后收集所有样品的孔隙水。阴离子用抑制电导检测的Dionex ICS-2000离子色谱仪定量。阴离子在AS11柱上用KOH梯度分离。

定量聚合酶链反应（qPCR）分析

墨西哥湾沉积物中细菌和古菌的丰度分别用引物Bact1369f/Bact1492r和Arc787f/Arc1059r，通过针对16srrna基因的定量（q）PCR进行估算（补充表1）。用不同的模板浓度（0.5、1、1.5ng的DNA）进行三次定量，以检测PCR抑制。扩增反应在Rotor Gene Q系统（德国希尔登Qiagen）中进行，最终体积为25 µl使用Brilliant III superMix（安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国），0.5 µ各底漆和5 µDNA模板的l。qPCR条件为：95℃变性40次 °C 15S，然后在60℃退火和延伸 °60秒。标准曲线一式三份，稀释度为0.001至100 丙酸脱硫菌（ATCC 33891）和甲基炔诺酮（ATCC 33938）DNA提取的nM。qPCR得到的标准曲线R2在0.99以上，PCR效率在94%以上。qPCR结果以每克沉积物的16srrna基因拷贝数表示。

Illumina Miseq扩增文库的制备、测序和分析

采用高通量16srrna基因测序技术测定了墨西哥湾沉积物的微生物群落组成。细菌16srrna基因的V4-V5区（420 用引物S-D-Bact-0516-a-S-18/S-D-Bact-0907-a-a-20扩增bp产物，而古细菌16srrna基因的V1-V2-V3区域（530 bp产物）使用引物S-D-Arch-0008-b-S-18/S-D-Arch-0519-a-a-19（补充表1）进行扩增，如先前应用于富含碳氢化合物的海洋沉淀物14。此外，利用引物DSR1728/DSR4R（380）对异种（bi）亚硫酸盐还原酶（dsrAB）基因进行扩增和测序，研究硫酸盐还原菌和产甲烷菌 bp产物）和甲基辅酶M还原酶（mcrA）基因 bp产品）（补充表1）。所有这些引物组产生PCR产物，使配对末端序列得以组装。将Miseq适配器（补充表1）融合到引物的5′区。所有PCR反应均采用Brilliant III super Mix（安捷伦）1进行，阴性对照为三份 µ每个底漆和1 µDNA模板在25 µ我的反应。所有PCR检测包括30个变性周期（95） °C 30分钟 s、退火30分钟在适当的温度（58 °C代表16S rRNA基因，55 °C代表dsrAB基因，50 °C代表mcrA基因），延伸30分钟她72岁了 °C，然后在72处进行最后的延伸步骤 °C代表5 使用Qiagen MinElute凝胶纯化试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）从琼脂糖凝胶中汇集并纯化最小复制扩增子。根据制造商的建议，使用Nextera XT试剂盒（Illumina Inc.，San Diego，CA，USA）对PCR产物进行索引。使用Qubit dsDNA-HS分析试剂盒（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Life Technology）对索引扩增子进行定量，并稀释以得到最终浓度为4的等摩尔产物混合物用于Miseq库准备的nM。将DNA文库稀释至4μm，然后按照制造商的建议，使用Illumina MiSeq v3试剂盒（Illumina Inc.，San Diego，CA，USA）进行双端Illumina MiSeq测序。这产生了2 × 300 bp对末端序列。使用Miseq reporter软件将数据集拆分为来自硅片中单个索引扩增子的读取。读取被组装成单对末端序列，这些序列用Qiime61进行管理。OTU拣货是使用新的OTU拣货选项进行的。质量分数低或使用UChime标记为嵌合体的序列被删除。使用BLAST与Silva版本11962、dsrAB 63和mcrA 64序列数据库作为参考，对读取的分类隶属关系进行比对和确定。原始序列保存在生物项目PRJNA385797下的NCBI公共数据库中。

宏基因组文库的制备、测序与分析

根据制造商的建议，使用Nextera XT文库试剂盒（Illumina，San Diego，CA，USA）从1ng的宏基因组DNA构建了6个沉积物样品的宏基因组。使用安捷伦生物分析仪2100（安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉）上的高灵敏度DNA芯片检查标记和索引。亚基因组标准化并稀释至4 基于生物分析仪分析确定的平均DNA片段大小和浓度。两个亚基因组在每个测序运行中以等摩尔量汇集。元基因组文库稀释至14.3pm，并使用Illumina Miseq V3试剂盒（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）测序。使用Illumina的MiSeq Reporter软件从仪器的元基因组数据中删除条形码和适配器序列，并将序列数据导出为fastq文件。使用Trimmomatic65对数据集进行质量过滤，使用配对末端照明数据的默认设置。使用与QIIME包（版本1.9）捆绑在一起的“join\u Paired\u ends.py”脚本（使用默认设置）完成成对端点连接。使用默认设置，通过MEGAHIT66的质量过滤，从成对末端连接读取和未配对读取执行组装。装配后，所有通过质量过滤的读取都映射回装配的重叠，以检测未包含在装配中的读取，使用BBMap67，使用默认设置。未映射到程序集的读取与组装的contig连接到一个fasta文件中，以上载到IMG/M分析管道68，用于基因调用和功能注释。对于每一个样本，覆盖率和定位数据文件（BAM文件）也被上传到IMG/M管道中，以保持基因的相对丰度。通过稀疏化对亚基因组进行标准化以进行样本比较。亚基因组数据可在IMG/M中获得，注册号如下：3300008340、3300008410、3300008416、3300008417、3300008465和3300008468（详情见补充表2）。使用vsearch69从用于扩增子分析的Silva数据库（Silva版本119）的元基因组数据中提取16S rRNA基因序列。用EMIRGE70重组全长16srrna基因。

统计分析

根据《微生物生态学统计分析指南》72，使用过去的软件71进行统计分析（相关表、单向NPMANOVA、SIMPER）。对于扩增子数据集，使用Bray-Curtis相异指数在97%的操作分类单位上确定样本之间的距离矩阵。采用基于Bray-Curtis相异性测度的单因素NPMANOVA和SIMPER检验，对群落组成和代谢潜力（已鉴定Kegg正交数）的差异进行了检验。

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