微生物qPCR定量检测
关于特定种类的微生物，客户可告知物种信息及引物信息，微基生物针对目标微生物进行qPCR定量分析；也可告知感兴趣的物种名称，微基生物来查询相关引物信息；如老师感兴趣的物种信息尚未见文献报道，微基生物可以开发程序，自行研发寻找目标菌株的特异基因并设计目标菌株的特异引物，验证引物的特异性，进行后继实验。
微基生物已检测过的物种信息，见表格（仅列出了常见的部分微生物种类），其他的微生物也可以检测。
|
级别 |
中文名称 |
英文名称 |
|
界 |
细菌 |
Bacteria |
|
界 |
真菌 |
Fungi |
|
界 |
古菌 |
Archaea |
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门 |
放线菌门 |
Actinobacteria |
|
门 |
拟杆菌门 |
Bacteroidetes |
|
门 |
厚壁菌门 |
Firmicutes |
|
纲 |
alpha变形菌纲 |
Alpha-proteobacteria |
|
纲 |
gamma变形菌纲 |
Gamma-proteobacteria |
|
科 |
肠杆菌科 |
Enterobacteriaceae |
|
科 |
瘤胃球菌科 |
Ruminococcaceae |
|
属 |
双歧杆菌属 |
Bifidobacterium |
|
属 |
大肠杆菌属 |
Escherichia |
|
属 |
乳酸杆菌属 |
Lactobacillus |
|
属 |
梭菌属 |
Clostridium |
|
属 |
肠球菌属 |
Enterococcus |
|
属 |
拟杆菌属 |
Bacteroides |
|
属 |
奇异菌属 |
Atopobium cluster |
|
属 |
链球菌属 |
Streptococcus |
|
属 |
瘤胃球菌属 |
Ruminococcus |
|
属 |
粪杆菌属 |
Faecalibacterium |
|
属 |
布劳特菌属 |
Blautia |
|
属 |
艰难梭菌属 |
Clostridium difficile |
|
属 |
脱硫弧菌属 |
Desulfovibrio |
|
属 |
另支菌属 |
Alistipes |
|
属 |
链球菌属 |
Streptococcus |
|
属 |
萨特氏菌属 |
Sutterella |
|
属 |
丙酸杆菌属 |
Propionibacterium |
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属 |
假单胞菌属 |
Pseudomonas |
|
属 |
噬酸菌属 |
Acidovorax |
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属 |
不动杆菌属 |
Acinetobacter |
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属 |
鞘氨醇单胞菌属 |
Sphingomonas |
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属 |
分枝杆菌属 |
Mycobacterium |
|
属 |
普氏菌属 |
Prevotella |
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种 |
溶纤维丁酸弧菌 |
Butyrivibrio fibrisolvens |
|
种 |
蛋白溶解梭菌 |
Clostridium proteoclasticum |
|
种 |
金黄色葡萄球菌 |
Staphylococcus aureus |
|
种 |
青春双歧杆菌 |
Bifidobacterium adolescentis |
|
种 |
鼠李糖乳杆菌 |
Lactobacillus rhamnosus |
|
种 |
粪肠球菌 |
Enterococcus faecalis |
|
种 |
呀卟啉单胞菌 |
Porphyromonas gingivalis |
|
种 |
阴道加德纳菌 |
Gardnerella vaginalis |
|
种 |
鼠乳杆菌 |
Lactobacillus murinus |
|
种 |
解淀粉芽孢杆菌 |
Bacillus amyloliquefaciens |
|
种 |
芽孢杆菌 |
Bacillus velezensis |
|
种 |
Akkermansia muciniphila |
|
|
种 |
酿酒酵母 |
Saccharomyces cerevisiae |
|
株 |
唾液链球菌 K12 |
Saliva streptococcs |
2 qPCR的原理
实时荧光定量PCR技术（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过相对定量（与内参基因对比）或绝对定量（通过标准曲线对未知模板进行定量）的方法确定各个样本的本底表达量。
3 3种荧光试剂的工作原理及区别
SYBRGreenⅠ法：
嵌入到双链DNA分子后在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
TaqMan探针法：
扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步
SYBRGREEN法和TaqMan探针法的区别
|
方法 |
优点 |
缺点 |
|
SYBR |
高灵敏度，操作简单，不影响酶促反应，价格便宜 |
1与探针法相比，对引物特异性要求较高，需进行熔解曲线分析 |
|
TaqMan |
1具有高度特异性 |
1探针价格较高 |
4 qPCR的实验方法
4 qPCR的实验方法
|
实验方法 |
原理 |
技术应用 |
相关应用 |
|
绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ) |
是测定目的基因在样本中的分子数目，通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量，即通常所说的拷贝数。 |
特定微生物的拷贝数检测 |
1临床疾病诊断 |
|
相对定量(RelativeQuantification，RQ) |
测定目的基因在样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的绝对拷贝数，一般是通过CT值之差来计算。 |
样本中某种特定微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例 |
相对定量和绝对定量的数据计算方法
每微升拷贝数（copies/μl）=[质粒浓度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆产物相对分子质量
原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA=拷贝数*稀释倍数
原始样本目标基因拷贝数copies/g样本=（原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA*基因组DNA体积）/样本抽提重量，（如果客户样本为DNA样本，则不需要计算copies/g样本）
相对定量的计算：
步骤1:内参基因均一化样本差异：Ct目的基因–Ct内参基因=△Ct
步骤2:其他样本和对照样本比较：△Ct处理样本–△Ct对照样本=△△Ct
步骤3:使用公式计算：倍数变化=2-△△Ct
5 qPCR的实验流程
6 qPCR检测送样要求
|
样本类型 |
样品量/例 |
备注 |
|
|
环境 |
土壤/沉积物/淤泥 |
1g |
|
|
湖水/海水/河水 |
1L，用滤膜或离心富集 |
过 0.22μm 的滤膜，或者 12000rpm 离心，进行富集。 |
|
|
污水 |
20ml |
若样本清亮则可适当地多取。 |
|
|
泥水混合样 |
2ml |
||
|
空气 |
根据实验需要，用无菌滤膜过滤空气。 |
||
|
发酵物 |
固体 2g，液体 20ml |
|
样本类型 |
样品量/例 |
备注 |
|
|
人体 |
粪便 |
≥3g |
|
|
皮肤 |
5 个采集拭子 |
采集 5cm*5cm 面积，反复刮取 20 次。 |
|
|
生殖道 |
5 个采集拭子 |
采集阴道口内 4cm 处分泌物， 每个拭子转 3 圈。 |
|
|
牙菌斑/舌苔 |
5 个采集拭子 |
在采集的部位，刮取 10 次左右。 |
|
|
唾液 |
10ml |
||
|
痰液 |
10ml 或 2-3 口痰液 |
||
|
鼻腔 |
5 个采集拭子 |
采集鼻腔内粘膜上的分泌物，转 3 圈。 |
|
|
肺部灌洗液 |
30ml 富集液 |
对灌洗液进行离心富集。 |
|
|
肠道/胃组织 |
5mm*5mm*3mm |
尽量多一取些。 |
|
|
血液 |
3ml 全血 |
用 EDTA 抗凝管，颠倒 8-10 次。 不建议用肝素。 |
|
|
尿液 |
30mL 尿液 |
取中段尿为宜。 |
|
|
母乳 |
5mL |
||
|
动物 |
粪便 |
≥3g |
最少 0.05g。 |
|
盲肠/结肠/胃 |
≥3g |
至少 1g，如果实验条件允许，尽可能多的收集样本 |
|
|
肠道内容物 |
≥3g |
最少 0.05g。建议客户自己取内容物，可以用 PBS 冲洗。 |
提醒
1 因为qPCR绝对定量最终得到的是单位重量，或是单位体积目标基因的拷贝数，所以如果客户送DNA，建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积，方便后继对数据进行转化。
2 送样时请尽量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保证运输过程中的低温条件（干冰的挥发消耗量约为 3-4 公斤/天）。在打包时放入足量的干冰， 将样本埋入干冰中， 为了保持冰盒中的低温环境，建议采用加厚的泡沫盒
7 qPCR结果
标准曲线
扩增曲线
熔解曲线
定量结果
|
微基编号 |
拷贝数 |
样本稀释倍数 |
抽提样本重量（g） |
基因组DNA体积（μL） |
原始样本目标基因拷贝数copies/μL DNA |
原始样本目标基因平均拷贝数copies/μL DNA |
原始样本目标基因拷贝数copies/g样本 |
原始样本目标基因平均拷贝数copies/g样本 |
|
1 |
1.08E+06 |
200 |
0.237 |
50 |
2.17E+08 |
2.26E+08 |
4.58E+10 |
4.76E+10 |
|
1 |
1.23E+06 |
200 |
0.237 |
50 |
2.47E+08 |
5.20E+10 |
||
|
1 |
1.07E+06 |
200 |
0.237 |
50 |
2.14E+08 |
4.51E+10 |
||
|
2 |
7.28E+05 |
200 |
0.24 |
50 |
1.46E+08 |
1.49E+08 |
3.03E+10 |
3.09E+10 |
|
2 |
7.55E+05 |
200 |
0.24 |
50 |
1.51E+08 |
3.15E+10 |
||
|
2 |
7.44E+05 |
200 |
0.24 |
50 |
1.49E+08 |
3.10E+10 |
||
|
3 |
1.24E+06 |
200 |
0.25 |
50 |
2.48E+08 |
2.59E+08 |
4.96E+10 |
5.19E+10 |
|
3 |
1.35E+06 |
200 |
0.25 |
50 |
2.69E+08 |
5.39E+10 |
||
|
3 |
1.30E+06 |
200 |
0.25 |
50 |
2.61E+08 |
5.21E+10 |
||
|
4 |
1.61E+06 |
200 |
0.234 |
50 |
3.21E+08 |
3.22E+08 |
6.87E+10 |
6.87E+10 |
|
4 |
1.60E+06 |
200 |
0.234 |
50 |
3.19E+08 |
6.82E+10 |
||
|
4 |
1.62E+06 |
200 |
0.234 |
50 |
3.24E+08 |
6.93E+10 |
||
|
5 |
1.27E+05 |
200 |
0.175 |
50 |
2.54E+07 |
2.66E+07 |
7.25E+09 |
7.59E+09 |
|
5 |
1.33E+05 |
200 |
0.175 |
50 |
2.66E+07 |
7.61E+09 |
||
|
5 |
1.39E+05 |
200 |
0.175 |
50 |
2.77E+07 |
7.91E+09 |
8 术语解释
Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
荧光阈值（threshold）的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基线（baseline）：在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，即称为基线。
熔解曲线Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料发实验结束后需对qPCR产物加热，随着温度的升高，双链接扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降，将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同，从而可对PCR的特异性进行鉴定。
9 参考文献
1 Tristano Bacchetti De Gregoris et.al. Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa.2011. Journal of Microbiological Methods.（厚壁菌门拟杆菌门alpha变形菌gamma变形菌等）
2 Baskar Balakrishnan et.al. Development of a real-time PCR method for quantification of Prevotella histicola from the gut.2017.Anaerobe.（普氏菌）
3 John Penders et.al. Quantification of Bifidobacterium spp., Escherichia coli and Clostridium difficile in faecal samples of breast-fed and formula-fed infants by real-time PCR.2005. FEMS Microbiology Letters.（双歧杆菌艰难梭菌大肠杆菌探针法）
4 Anders Bergstrom et.al. Introducing GUt Low-Density Array (GULDA) – a validated approach for qPCR-based intestinal microbial community analysis.2012. FEMS Microbiology Letters.（多种菌的定量）
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