遗传转化的基本知识（一）—

自1983年第一个转基因植物问世以来只有20多年的时间，但植物基因工程的发展日新月异，硕果累累。将外源基因人为导入天然植物中，从遗传物质水平上对植物进行有目的改造，由此获得转基因植物，其性状将按着有利于人们需要的方向发生改变。植物基因工程具有得天独厚的优势是植物细胞的“全能性”理论。这是动物细胞所不能比拟的，其次是植物基因工程不会像动物或人类基因工程那样遇到较多的社会、伦理、道德等问题。植物基因工程为育种开辟了一条崭新的途径。

经过十多年来得探索，基因转化的技术日臻成熟，已经形成了以农杆菌载体转化和基因枪转化技术为主体的两大植物基因转化系统。这两种转化系统机理清楚、证据确凿，成功的例子最多，约占已获转基因植物的90%以上。

植物基因转化的受体：所谓基因转化受体是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，转化选择抗生素敏感的再生系统。

尽管接受外源基因的受体包括叶圆片(盘)、胚性愈伤、胚状体、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态，但其基本形态还是细胞。其中，叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法；愈伤组织的转化效率高、生长速度快，是快速检测外源基因表达的最好受体；原生质体则是单克隆转化的最佳材料。

植物基因转化的受体包括：

1、原生质体：原生质体是无细胞壁的细胞。与悬浮细胞一样，被转化的受体是单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。

水稻广亲和品种‘02428’的原生质体用聚乙二醇(PEG)法导入具有潮霉素B(HPT)抗性基因、卡那霉素抗性基因(KanR)和昆虫荧光素酶基因(Luc)的质粒pTHL27DNA，在含有25μg/ml潮霉素B和100μg/ml卡那霉素的培养基KPR和N6上连续培养处理4周，可以很好地除去非转化的敏感的原生细胞；然后在无抗菌素选择压力的培养基中，转化细胞可再生植株(杨歧生等，1996)。

2、悬浮细胞：以悬浮细胞作受体的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法、电激法和显微注射法等。

小麦幼胚悬浮细胞用JQ-700基因枪法转化，得到了GUS基因瞬间表达的各项最适参数。他们还建立了‘冀谷11号’谷子幼穗的悬浮培养细胞系及植株再生体系。将胚性悬浮细胞系接种到MS培养基，20d继代1次，直至出现绿芽；然后转入无激素的MS0或1/2MS0培养基分化植株。以基因枪轰击转化悬浮细胞后，放置48h，检测GUS短暂表达频率TTF％为20％-40%；在添加200mg/L卡那霉素的MS培养基上，有5％-10％的愈伤组织具有抗性，且能稳定传代(董云洲等，1998)。

3、胚性愈伤组织：愈伤组织的转化方法也适用于胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的转化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。芹菜胚性愈伤组织用根癌农杆菌C58C1(pBZ6111)感染后，在MS+2,4-D1mg/L十KT0.1mg/L培养基上继代培养。在筛选到的氯霉素抗性愈伤组织中检测到胭脂碱合成酶活性，表明外源基因已整合到芹菜细胞基因组中并得到表达。抗性愈伤组织可在无激素的基本培养基上增殖，但分化出的再生植株畸形(郑世学等，1996)。

4、胚状体

胚状体是由愈伤组织经过改造后分化而来的，其转化方法也同愈伤组织。

比如：用根癌农杆菌LBA4404介导番木瓜环斑病毒外壳蛋白（PRSV-CP）与核酸酶（Nuclease）嵌合基因，通过振动共培养法转化番木瓜子叶型胚状体，在选择培养基上筛选诱导再生转基因植株。NPTII分析和Southernblot分子杂交结果表明，PRSV-CP-Nuclease嵌合基因已经整合到番木瓜核基因组中（周鹏等，1995）。

5、叶圆片：叶圆片(叶盘)是农杆菌转化的主要受体。采取新鲜植株上无菌的幼嫩叶片，用打孔器或解剖刀切取直径3-5mm的叶圆片，在液体培养瓶中与农杆菌共培养20-30min，其间轻轻摇动使农杆菌从切口侵入叶片。然后将共培养后的叶圆片在滤纸上吸干，转移到非选择性培养基上培养3d，再转入含卡那霉素或羧苄青霉素等抗生素的选择培养基上培养，诱导植株再生，这样可获得遗传均一性较高的转基因植株。

叶盘法常见于双子叶植物的遗传转化，马铃薯“东农303’’的叶盘用含有质粒pPZH1和辅助质粒pGV2260双元载体的根癌农杆菌菌株C58C1进行转化，在选择培养基上培养30d后，叶盘切口形成抗性愈伤组织，转化率为4％-38％；经NPTII酶活性分析和DNA分子杂交证实获得了转基因再生植株(王光清等，1994)。

6、其他受体：除了叶圆片、愈伤组织、悬浮细胞或原生质体等几种常见的受体之外，还有多种不同类型的组织或器官可作为外源基因的受体，如：子叶、胚轴、茎段、根、体细胞胚、花粉等等。

比如将切成小段形成一定伤口的金鱼草下胚轴与根癌农杆菌LBA4404(p35SGUSINT)共培养，通过不定芽途径获得抗G418的再生植株，经DNA/DNA斑点杂交及GUS活性原位组织检测，初步证实外源基因GUS已整合到金鱼草基因组并得到表达(余迪求等，1996)。

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