遗传转化的基本知识（四）——植物遗传转化的载体系统
植物遗传转化的载体系统
作为植物遗传转化的载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。质粒载体系统中最常用的质粒有：Ti 质粒和 Ri 质粒。Ti质粒存在于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，Ri 质粒存在于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenis）中。Ti 质粒和 Ri 质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性。但实际工作中，绝大部分采用 Ti 质粒。目前的载体系统有病毒的载体系统和质粒的载体系统两大类。下面我们着重介绍目前用的醉倒的Ti质粒载体系统。
农杆菌质粒是一种能实现 DNA 转移和整合的天然系统。
Ti 质粒四个个区域：
①T-DNA 区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域）和 Vir区（编码能够实现 T-DNA 转移的蛋白）。T-DNA 长度为 12-24kb 之间，两端各有一个含 25hp 重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的 T-DNA 可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对 DNA 的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA 并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。
②Vir 区位于 T-DNA 以外的一个35kb 内，其产物对 T-DNA 的转移及整合必不可少。农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口，受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导 Vir 基因的表达。Vir 产物能诱导 Ti 质粒产生一条新的 T-DNA 单链分子。此单链分子从 Ti 质粒上脱离后，可以与 Vir 产物 VIRD2蛋白共价结合，并在 VIRD4 和 VIRB 等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。
③ Con区（regions encoding conjugations）
该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移， 因此称之为接合转移编码区。
④ Ori区（origin of replication）
该区段基因调控Ti质粒的自我复制， 故称之为复制起始区。
Ti质粒的改造：
由于野生型 Ti 质粒过于庞大，约 200-800kb，为了便于重组 DNA 操作，研究人员对 Ti质粒进行了改造从而构建一系列合适的 Ti 衍生载体。首先除掉了野生型 Ti 质粒 T-DNA 区的一段 DNA 片段。例如：参与植物生长素和细胞分裂素的基因（这些基因过度表达植物激素，从而破坏受体细胞和激素产量）。此外需在 Ti 质粒上加上 E．Coli 复制起始位点，使得插入外源基因的 Ti 质粒在为一个穿梭载体，不但可在农杆菌中复制，而且便于在 E．Coli中重组操作与保存。
植物转化载体系统
植物转化载体系统包括一元载体系统和双元载体系统。
人们在研究中发现在 T-DNA 转移过程中，Vir 基因并不一定与 T-DNA 位于同一个质粒上，于是通过构建中间载体解决了 Ti 质粒不能直接导入目的基因的困难。
大肠杆菌具有能与农杆菌高度接合转移的特性，因此研究者可以将 T-DNA 片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把上源基因引入到农杆菌的 Ti 质粒上。这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的 T-DNA 引入 Ti 质粒的有效方法。
中间载体：带有重组 T-DNA 的大肠杆菌质粒的衍生载体称为“中间载体”（intermediate vector）。
受体质粒：接受中间载体的 Ti 质粒则称为受体 Ti 质粒（acceptor Ti plasmid），一般是卸甲载体（disarmed vector）。
卸甲载体：所谓卸甲载体就无毒 Ti 质粒载体。因为利用野生型的 Ti 质粒作载体时影响植株再生的直接原因是 T-DNA 中onc 基因的致瘤作用。因此为了使野生型的 Ti 质粒成为基因转化的载体，必须切除 T-DNA 的one基因，而“解除”其“武装”，构建成所谓的“卸甲”或称“缴械”载体。在这种omc-载体中已经缺失的 T-DNA 部分被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322 取代。这样任何适合于克隆在 pBR322 质粒的外源 DNA 片段都可以与 pBR322 质粒DNA 同源重组，而被其整合到 onc-Ti 质粒载体上。中间载体通常是多拷贝的 E．coli 小质粒，这一点对 Ti 通过体外操作导入外源基因是非常必要的。
两类中间载体
从结构特点看可分为两类中间载体：即共整合系统中间载体和双元系统中间载体。根据两类中间载体，目前已开发出两类转化体系：
一类是一元载体系统（整合载体系统）：这一类载体系统由一个共整合系统中间表达载体与改造后的受体 Ti 质粒组成。在农杆菌内，通过同源重组将外源基因整合到修饰过的 T-DNA 上，形成可穿梭的共整合载体，在 Vir 基因产物的作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。但这类方法构建困难，整合体形成率低，一般不常用。
另一类转化体系是双元载体系统：它由两个分别含有 T-DNA 和 Vir 区的相容性突变 Ti质粒即：微型 Ti 质粒（mini-Ti plasmid）和辅助 Ti 质粒（helper Ti plasmid）构成，T-DNA和 Vir 基因在两个独立的质粒上，通过反式激活 T-DNA 转移到植物细胞基因组内。微型 Ti质粒就是含有 T-DNA 边界缺失 Vir 基因的 Ti 质粒，为一个广谱质粒。它含有一个广泛寄主范围质粒的复制起始位点（OriV），同时具有选择性标记基因。辅助质粒为含有 Vir 区段但T-DNA 缺失的突变型质粒，完全丧失了致瘤的功能。因此相当于共整合载体系统中的卸甲质粒。其作用是提供 Vir 基因功能。激活处于反式位置上的 T-DNA 转移。
质粒转入农杆菌的途径：
将微型质粒转入到含有辅助性 Ti 质粒农杆菌的途径有两条：一条是直接用纯化的微型 Ti 质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞；另一条途径是采用三亲交配方法，三亲交配由含微型 Ti 质粒的E．Coli、含有助动质粒 pRK2013 的 E.Coli 和含有辅助 Ti 质粒的农杆菌组成。三细菌混合后产生菌间的接合转导。pRK2013 可移入农杆菌，但由于不能自主复制而被丢失，其进入含有微型 Ti 质粒的 E．Coli 后，可促进微型 Ti 质粒一起或分别转移入农杆菌中。但由于pRK2013 的“自杀”特性，最终在农杆菌中剩下微型 Ti 质粒和 Ti 质粒双元载体，此农杆菌可直接用于植物细胞转化。双元载体不需经过两个载体的共整合过程。因此构建的操作过程比较简单；由于微型 Ti 质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到农杆菌比较容易，且构建的频率较高。另外，双元载体在外源基因的植物转化中效率高于一元载体。
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