第 11-12 讲基因功能研究技术

文章目录

8. 基因功能研究技术
- 8.1 基因活性的操控技术
- - 8.1.1 过表达 (overexpression)
  - 8.1.2 基因定点突变 (site-directed mutagenessis) 技术
  - 8.1.3 RNAi 技术
  - 8.1.4 基因敲除 (gene knock-out) 技术
- 8.2 基因表达检测技术
- - 8.2.1 第一代测序技术 Sanger dideoxy sequencing
  - 8.2.2 第二代测序技术
  - - 8.2.2.1 Roche / 454 : Genome Sequencer FLX
    - 8.2.2.2 lllumina Solexa cyclical base addition
    - 8.2.2.3 ABI SOLiD sequencing by ligation （用得不多）
  - 8.2.3 第三代测序：单分子测序技术
- 8.3 功能调控与检测技术（没讲）
- - 8.3.1 表达量
  - 8.3.2 酵母单杂、双杂交系统
  - 8.3.3 各类相互作用技术
  - 8.3.4 标记和荧光成像技术

8. 基因功能研究技术

8.1 基因活性的操控技术

可以过表达、全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因过表达或者缺失后生物体的表型变化研究基因功能。

8.1.1 过表达 (overexpression)

重组 DNA 技术 (Recombinant DNA technology)：显性阴性蛋白
蛋白质在细胞内往往是与其他蛋白质分步装配形成复合物，一起发挥作用。如果只是过表达其中一个蛋白，可能只是影响复合物的装配，而不影响复合物功能；但如果过表达蛋白质的突变体（利用重组 DNA 技术，Recombinant DNA technology ），很可能影响整个复合物的功能。

8.1.2 基因定点突变 (site-directed mutagenessis) 技术

基因定点突变 (site-directed mutagenessis, in vitro)：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造 DNA 调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。

聚合酶链反应 (PCR) 的应用

(1) 亚克隆 (Subcloning DNA targets using PCR)

T/A 克隆
在引物中加限制性内切酶位点
平端连接 (Blunt-end Ligation)

◆ 使用 PCR 亚克隆 DNA 靶标

◆ 在引物中加入限制性内切酶酶切位点，PCR 扩增后酶切得到粘性末端，连接到载体中去。

(2) 产生 DNA 探针 （两种方法）

直接合成（试剂公司）
通过 PCR 产生单链 DNA 探针：控制上下游引物的比例，原理类似 TAIL-PCR。
PCR 产生用于体外转录的模板：在不配对区设计引物，在引物中加入 T7 promoter 序列（即测序引物），使 PCR 产物含有 T7 promoter，可以用来转录得到 RNA。

(3) PCR 的诊断应用

使用基因组特异性引物对检测病原体
筛选未知突变的特定基因
使用已知的 STS 标记进行基因分型

PCR 介导的定点突变 (重叠延伸法) PCR-mediated in vitro mutagenesis

目的：将图中的 AA/TT 突变为 CC/GG
方法：设计 重叠互补引物。
① 用上游引物 P1 和下游带有 GG 突变的引物 P2 扩增得到带突变位点 CC 及上游序列的 DNA 片段；
② 用上游带 CC 突变的引物 P3 和下游引物 P4 扩增得到带突变位点 GG 及下游序列的 DNA 片段；（P3 与 P2 引物有重叠区）
③ 将两个 PCR 产物混合，进行 PCR 延伸，此时只有 5’-3’方向可以延伸。
④ 以延伸反应产物为模板，以 P1/P4 为引物扩增，得到最终产物。
重叠延伸 PCR 技术 (SOE PCR) 是指在 PCR 技术的基础上，采用 具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术可以很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成功的关键是重叠互补引物的设计。SOE PCR 在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
原理：在重叠延伸 PCR 中，两个重叠的 DNA 片段是分别从两个独立的 PCR 扩增反应得到的。预设突变构建在重叠区域，存在于两个扩增片段中。设计 4 种引物，用第一对引物扩增含有突变位点及其上游序列的 DNA 片段，第二对引物被用来扩增含突变位点及其下游序列的 DNA 片段，两个侧翼引物含野生型序列，两个突变引物含有希望引进的突变位点，如置换插入或缺失。混合两次 PCR 的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠片段之间退火，延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次 PCR，即可得到目标突变体。
参考资料：
重叠延伸 PCR
利用重叠延伸 PCR 技术进行 DNA 的人工合成

多位点突变反应 (MMR) 策略

设计两对突变引物，突变位点设计在引物（MP1/MP2）中，进行两个不同的扩增，扩增产物上下游各有一个缺口，连接缺口，再进行第二轮扩增。
选择扩增的酶比较重要，应不具有 3’-5’外切酶活性，使 PCR 扩增停止在突变位点处产生缺口（只能线性扩增而不能指数扩增）。

● 重叠延伸介导的定点诱变机制

首先将模板 DNA 分别与引物对 1（正向诱变引物 FM 和反向引物 R2) 和引物对 2（正向引物 F2 和反向诱变引物 RM) 退火，通过 PCR1 和 PCR2 扩增出两种靶基因片段。
FMR2 和 RMF2 片段在重叠区发生退火，用 DNA 聚合酶补平缺口，形成全长双链 DNA, 进行 PCR3 扩增。
最后，用引物 F2 和 R2 扩增出带有突变位点的全长 DNA 片段 (PCR4)。

● 大引物诱变法

首先用正向突变引物 (M) 和反向引物 (R1), 扩增模板 DNA 产生双链大引物 (PCR1), 与野生型 DNA 分子混合后退火并使之复性。
第二轮 PCR2 中加入正向引物 (F2), 与 PCR1 中产生的一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链 DNA。
由于 P2 的退火温度显著高于第一轮 PCR 所使用的引物 M 和 R1, 因此，可以忽略引物 M 和 R1 在本轮反应中所造成的干扰。获得定点突变 PCR 产物以后，一般需进行 DNA 序列分析以验证突变位点。

● 参考文献：改进的多片段重叠延伸 PCR 制作基因多位点突变
采用重叠延伸 PCR（overlap extension PCR，OE-PCR）法：第一轮 PCR 扩增出三个片段，第二轮 PCR 同时利用三片段重叠延伸产物作为模板扩增出目标基因突变体，再按常规分子克隆方法将其连入质粒载体。

PCR 介导的缺失突变

目的：使基因片段中产生缺失片段（图中红色和紫色之间的 DNA 片段）
原理与定点突变类似，利用 OE-PCR 的方法，根据缺失片段两侧的序列设计可以反向互补的引物 P2/P3，分别与 P1/P4 扩增，混合延伸，再将延伸产物用 P1/P4 扩增，得到最终产物。

The Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) 聚合酶不完全引物延伸

参考文献：The Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) method applied to high-throughput cloning and site-directed mutagenesis [PMID: 18988020]
使用 PIPE 方法，所有主要的克隆操作均通过在扩增后立即用 PCR 产物转化感受态细胞来实现。普通的 PCR 会产生不完全延伸产物的混合物。使用简单的引物设计规则和 PCR，在这些不完全延伸混合物的末端引入短的重叠序列，使互补链退火产生杂交的载体/插入序列杂交体。这些杂交体在没有任何 PCR 后的酶促操作的情况下直接转化为受体细胞。
利用 PIPE 进行克隆，在载体中插入一个外源基因（A.B）/ 突变 (C.)
PIPE 方法中使用的（A.B.C）三种常见 PCR 扩增的寡核苷酸设计，每个引物 5 '末端的前 15 个碱基被设计成互补序列。
A. V-PIPE (vector PCR)：引物 1 和 2 可用于扩增载体，例如 SpeedET。
B. I-PIPE（插入 PCR)：引物 3 和 4 可以用于扩增来自不同模板的插入片段（目的片段）。
P1 与 P3 ，P2 与 P4 的 5’端有 15 个碱基的反向互补序列（overlap），因此目的片段可以与载体重组相连。
C. M-PIPE（突变 PCR)：引物 5 和 6 可用于产生点突变。引物 7 和 8 可用于构建缺失突变体。引物 9 和引物 10 可用于构建插入突变体。
参考文献：基于 PIPE 现象的质粒克隆位点序列设计与功能评价

8.1.3 RNAi 技术

RNAi (RNA interference, RNA 干扰）技术：利用双链 miRNA 高效、特异性降解细胞内同源 mRNA 从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi 的命名来源于安德鲁·法尔。

双链 miRNA 是 RNAi 的触发物，引发与之互补的单链 RNA (ssRNA, single-stranded RNA）的降解。细胞核中 DNA 转录出 pre-miRNA，加工后形成带 loop 环的双链 miRNA 进入细胞质。
经过 Dicer酶（一种具有 RNAaseⅢ 活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链 RNA (30 个核苷酸以上）首先被降解（切掉 loop 环）形成 21～25 个核苷酸的小分子干扰核糖核酸 (siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目标 mRNA。siRNA 是导致基因沉默和序列特异性 RNA 降解的重要中间媒介。
较短的双链 RNA 不能被有效地加工为 siRNA, 因而不能介导 RNAi。
siRNA 具有特殊的结构特征，即 5’-Pi 和 3’-OH，其两条链的 3’端各有两个碱基突出于末端。由 siRNA 中的反义链指导合成一种被称为 RNA 诱导的沉默复合体 (RISC) 的核蛋白体，再由 RISC 介导切割目的 mRNA 分子中与 siRNA 反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。
siRNA 还可作为特殊引物，在依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶的作用下，以目的 mRNA 为模板合成 dsRNA, 后者又可被降解为新的 siRNA, 重新进人上述循环。因此，即使外源 siRNA 的注入量较低，该信号也可能迅速被放大，导致全面的基因沉默。
在哺乳动物细胞内，较长的 dsRNA 会导致非特异性基因沉默，只有 21~25 个核苷酸的 siRNA 才能有效地引发特异性基因沉默。
非哺乳动物细胞可以利用较长的双链 RNA 直接诱导产生 RNAi 而无须合成 siRNA, 因此，设计非哺乳动物细胞 RNAi 实验的步骤比较简便，只要通过目的基因体外转录得到所需要的 dsRNA, 再通过浸泡，注射或转染靶细胞即可实现 RNAi。

8.1.4 基因敲除 (gene knock-out) 技术

经典遗传学 (Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。
现代遗传学 (Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测或者观察表现型，进而推导出该基因的功能。
基因敲除 (gene knock-out) 又称基因打靶，通过外源 DNA 与染色体 DNA 之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体 DNA 可与目的片段共同稳定遗传等特点。

基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。
完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物个体中的靶基因活性。
条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。

(1) 完全基因敲除实验

完全基因敲除实验中一般采用取代型 (a) 或插入型 (b) 载体在 ES 细胞（胚胎干细胞 embryonic stem cell）中根据正-负筛选 ( positive-negative selection, PNS) 原理进行完全基因敲除实验。

正向选择基因 neo 通常被插入载体靶 DNA 功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。neo 基因有双重作用，一方面形成靶位点的插入突变，同时可作为正向筛选标记。
负向选择基因 HSV-tk (human semian virus-thymidine kinase，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因）则被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。如果细胞中发生了随机重组，负向选择基因就可能被整合到基因组中，导致细胞死亡。
正-负筛选法 (PNS 法） 筛选已发生同源重组的细胞（此方法效率低，现已不用于做基因敲除，用 CRISPR 方法）

◆ 目标序列的关键外显子中插入 neo^r 基因，两侧为 HSV-tk；
◆ 在 ES 细胞中发生同源重组后，neo^r 基因插入基因组中，而 HSV-tk 基因被剪切掉；
◆ 发生重组的 ES 细胞由于有 neo^r 基因而获得对新霉素 G148 抗性。因为缺失了 HSV-tk 基因，转化细胞同时具有嘌呤类似物丙氧鸟苷抗性。

高等动物基因敲除技术

真核生物基因敲除的技术路线：构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组 DNA 导入胚胎干细胞纯系中，使外源 DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的 DNA 序列整合到内源基因组中并得以表达。
显微注射命中率较高，技术难度相对大些。
电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。
胚胎干细胞（ES 细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。

模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用

肠碱性磷酸酶（Intestinal Alkaline Phosphatase，IAP）基因敲除加速小鼠肥胖
(a) 利用 neo 基因替换目的基因外显子Ⅳ至外显子Ⅵ区段，得到 IAP 基因敲除的 ES 细胞。P. 内源 Southern 印迹探针。
(b) Southerm 印迹实验 （DNA 水平），AP 基因已从基因组中敲除。
◆ D3, 来自于亲本 ES 细胞的 DNA;
◆ # 48, IAP 基因敲除的 ES 细胞 DNA;
◆ +/+、+/-和-/-分别代表野生型、杂合体和纯合体。
(c ) Northem 印迹实验 （RNA 水平），纯合小鼠体内 IAP 基因不表达。
(d) Western 印迹实验 （蛋白质水平）。纯合小鼠体内检测不到 IAP 蛋白。TNAP, 非组织特异性碱性磷酸酶。
(e) 在高脂饲养条件下，IAP 基因敲除的小鼠 ( ko) 较野生型小鼠 ( wr) 更易发胖。

(2) 条件型基因敲除

噬菌体的 Cre/LoxP 系统、Gin/Gix 系统、酵母细胞的 FLP/FRT 系统和 R/RS 系统是现阶段常用的四种条件型定位重组系统，尤以 Cre/LoxP 系统应用最为广泛。

Cre/LoxP 系统

Cre 是来自大肠杆菌噬菌体 P1 中的一种特异重组酶，能识别 34bp 的 loxP 序列（序列短，容易插入基因组），并介导两个 loxP 位点之间的基因序列被删除或重组。
loxP 序列：来源于 P1 噬菌体，是由两个 13bp 反向重复序列和中间间隔的 8bp 序列共同组成，8bp 核心序列同时也确定 LoxP 的方向。Cre 在催化 DNA 链交换过程中与 DNA 共价结合，13bp 的反向重复序列是 Cre 酶的结合域。其序列如下：
5’ - ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT - 3’
3’ - TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA - 5’
Cre 重组酶介导两个 LoxP 位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：

◆ Cre-lox 重组的结果取决于侧翼 loxP 位点的方向和位置：
① 如果两个 LoxP 位点位于一条 DNA 链上，但方向相反，Cre 重组酶能导致两个 LoxP 位点间的序列倒位；
② 如果两个 LoxP 位点分别位于两条不同的 DNA 链或染色体上（反式排列），Cre 酶能介导两条 DNA 链的交换或染色体易位。
③ 如果两个 LoxP 位点位于一条 DNA 链上，且方向相同（顺式排列），Cre 重组酶能有效切除两个 LoxP 位点间的序列。

条件型基因敲除策略

条件型基因敲除打靶载体时，常将正向选择标记 neo^r 置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域（如图中 Exon 2）两侧内含子中插入方向相同的 LoxP 位点。
当实验中需要消除靶基因活性时，与带有 Cre 重组酶基因的 ES 细胞杂交，Cre 重组酶就能把两个 LoxP 位点中间的 DNA 片段切除，导致靶基因失活。
标记基因 neo^r 两侧也常常带有 LoxP 序列，因为许多时候即使标记基因位于内含子中也会阻断靶基因的转录。一旦出现这种情况，可以用 Cre 重组酶表达质粒转染中靶 ES 细胞，通过 LoxP 位点重组将 neo 抗性基因删除。

肝组织特异性表达 Cre-Lox 系统条件型敲除小鼠 40S 核糖体蛋白 S6 基因导致肝细胞分裂增殖受阻

● Conditional KO mice: inducible cre-lox recombination
Cre 重组酶融合至突变体雌激素配体结合结构域，其需要存在雌激素拮抗剂他莫昔芬用于激活重组酶 (CreERT2）。

● 细胞特异性 Tet-ON （四环素诱导的表达系统）
TetO（四环素响应启动子/操纵子）在用四环素类似物强力霉素（DOX）激活反向四环素反式激活因子 (rtTA）后驱动 cre 重组酶的表达。

基因捕获法原理

除了基因敲除法，还有人用基因捕获的方法通过随机插入突变破坏靶基因表达。
基因捕获载体包括一个无启动子的报告基因（通常为 neo^r 基因）, 当该基因插入到 ES 细胞染色体某个部位，利用所在位点的转录调控元件得到表达时，该 ES 细胞就获得在含 G418 的选择性培养基上生长的能力。可通过分析标记基因侧翼 cDNA 或染色体 DNA 序列来获得靶基因的相关信息。

A、未插入基因捕获载体前，需要被敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白质，未知；
B、插入基因捕获载体后，靶位点基因转录翻译出带有 GUS 蛋白区段的融合蛋白，可用组化方法检测。
Gus 基因来自于大肠杆菌，编码 β-葡聚糖苷酶 (β-glucuronidase，一种水解酶），可催化底物 5-溴-4-氯-3-吲哚葡聚糖醛酸苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide, 缩写为 x-Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。

植物基因敲除技术

T-DNA 插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。
利用根癌农杆菌 T-DNA 介导转化，将带有报告基因的 DNA 序列整合到基因组 DNA 上，如果这段 DNA 插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。
由于该基因内部或附近插入了一段已知序列的 DNA, 可据此设计引物，用 PCR 方法将被破坏的靶基因序列分离出来。
植物基因敲除及突变体筛选

若将靶基因（假定编码区为 900 bp) 两端的引物 LP、RP 及插入载体上的引物 LB 加入同一反应体系中进行 PCR, 理论上能得到三种类型的条带：
◆ 野生型植株中，只有 LP 和 RP 引物配对扩增出来的靶基因条带；
◆ 纯合型基因敲除植株，只有靶基因一端的引物可以与 LB 引物配对完成 PCR 扩增；
◆ 杂合型基因敲除植株，PCR 扩增后会同时出现两种条带。

基因的定点整合技术

（一） TALEN 介导的基因组定点修饰技术

TALEN: transcription activator-like effector nucleases 类转录激活因子效应物核酸酶，是一类人工核酸内切酶。由特异性的TALE DNA 结合结构域和非特异性FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。
人工构建的序列特异性核酸内切酶能识别并切割特定的 DNA 靶序列，造成双链断裂，从而引起基因组结构的定点改变。
参考资料★★★：TALEN 介导的基因组定点修饰技术 .ppt

● TALE 识别模块

RVD: Repeat variable di-residue 重复可变双残基
NLS: Nuclear localization signal 核定位信号
AD: Activation domain 转录激活结构域
TALE 蛋白 N 端一般有转运信号；C 端有核定位信号和转录激活结构域；中部则是介导其与 DNA 特异识别与结合的结构域，包含一段 12 个或以上的长串联重复序列。
在每个重复单位中，包含 34 个氨基酸，第 +12 和+13 位氨基酸残基是靶向识别碱基的关键位点，随靶点核苷酸序列的不同而异，被称作重复可变双残基 (Repeat variable di-residue, RVD)；其他位置的氨基酸残基则相对固定。
每个 RVD 只能识别一个碱基。最常见的 4 种 RVD 分别是 NI(Asn Ile) 识别 A、NG(Asn Gly) 识别 T、HD(His Asp) 识别 C、 NN(Asn Asn) 识别 G/A。TALE 的重复单元与靶序列一一对应。

● TALEN 介导的基因组定点修饰流程

在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔 13-22 碱基）的靶序列（一般 16-20 个碱基）分别进行 TALE 识别模块构建。将这两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到 FokⅠ 的 N-末端，形成真核表达载体，得到 TALEN 质粒对。将 TALEN 质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。
TALEN 质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个 TALEN 融合蛋白中的 FokⅠ 临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性（FokⅠ只有形成二聚体才切），在两个靶位点之间剪切 DNA，造成 DNA 双链断裂 DSB (Double-Strand Breaks，DSB)，诱发 DNA 损伤修复机制。
切割后（细胞 DNA 损伤后）会启动两种修复机制：
① 非同源末端连接 NHEJ（Non-homologous End Joining）修复：简单高效，错误率高，>70% 产生基因突变，造成移码，形成目标基因敲除突变体。
② 同源重组 HR 修复：有模板存在时发生同源重组，造成基因敲入和修改，效率低，保真度高。

● TALEN 靶位点的挑选原则：

TALEN 靶位点 5 端的前一位（第 0 位）碱基应为胸腺喀啶 (T)
设计 TALEN 靶点网站：TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0

（二） CRISPR/Cas 系统

在原核生物中，聚集的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR）和 CRISPR 相关 (Cas) 系统 (clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system) 是针对病毒和质粒的适应性免疫应答细胞，使用引导 RNA 来切割外源 DNA 序列。
Ⅱ型 CRISPR 系统 体外切割所需的最小组分是来自化脓链球菌 (Streptococcus pyogenes）的 Cas9 核酸酶和合成的指导 RNA (sgRNA)。sgRNA 由短 CRISPR RNA(crRNA）和反式激活 CRISPR RNA ( tracrRNA）组成。
原理与 TALEN 类似，不同的是，CRISPR/Cas 是通过 sgRNA 来识别靶 DNA 序列。

CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑

CRISPR 系统使用单个指导 RNA（红色）靶向感兴趣的 DNA。
Cas9 核酸酶（绿色）识别 sgRNA 和 RNA:DNA 杂交体的二级结构。通过 crRNA 内的 20bp 序列提供基因组特异性。
Cas9 还需要原型间隔区基序 5’-NGG-3’ (Protospacer-Adjacent Motif, PAM）来切割 DNA。

CRISPR/Cas9 切割后修复：
1）基因敲除：在基因上产生 DSB ( 3bp upstream of the PAM site )，NHEJ 修复的过程中往往会产生 DNA 的插入或删除（indel)，造成移码突变，从而实现基因敲除。
2）特异突变引入：通过含有特异突变同源模板的同源重组 (homology directed repair，HDR) 来实现。DSB 会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。
3）定点转基因：通过含有转基因的同源模板的同源重组来实现。通过定点转基因的方法可以把基因插入到人的基因组 AAVS1 位点，这个位点是一个开放位点，支持转基因长期稳定的表达，破坏这个位点对细胞没有不良影响。
CRISPR/Cas9 系统已不仅仅是一种革命性的基因编辑工具，还能在各种原核和真核生物中调控基因转录。Cas9 的核酸酶发生双突变产生失活的 dCas9，即“dead Cas9"”，这种核酸酶失去切割 DNA 的功能，但在 gRNA 的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合 DNA。
参考文献： Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells
有别于绝大多数体细胞基因组，适应性免疫系统在淋巴细胞发育过程中可以进行高效编辑，对抗原受体进行高效突变，产生近乎无限的抗原受体库，用以抵御可能的病原体入侵。受这一机制的启发，研究小组发现诱导抗体高频突变的胞喀啶核苷脱氨酶（ activation-induced cytidine deaminase，AID）与失活的 dCas9 融合后，实现了功能变异的高通量筛选。在 sgRNAs 的引导下，dCas9-AID-P182X(AIDx) 可直接将胞密啶 C 或鸟嘌呤 G 转变为其它三种碱基，在预期位点产生一系列的变异。
参考资料：
CRISPR/Cas 技术及其作用机制
CRISPR-dCas9 转录调控系统简介

单碱基编辑 Single base editing

参考文献： Programmable base editing of AT to G·in genomic DNA without DNA cleavage
不同于 CRISPR，碱基编辑不会切割双螺旋，而是使用酶将碱基转换为碱基而不改变其周围的碱基。
利用 CRISPR-dCas9 定位到目标碱基处，dCas9 融合了一种特殊的酶（能对碱基发生修饰）

载体构建实例解析
详见：载体构建实例解析——构建 SETD3-pEGFP-N1

8.2 基因表达检测技术

为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。

基因组序列的测定

基因组（genome）是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部 DNA 分子的总和。
基因组学（genomics）是指研究并解析生物体整个基因组的所有遗传信息的学科。

● 不同模式生物基因组的比较

鸟枪法序列测定技术

全基因组鸟枪法测序 (shotgun sequencing) 技术：随机挑选带有基因组 DNA 的质粒进行末端序列测定，然后用计算机程序进行序列拼接。
鸟枪法测序的主要缺点：
1）随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加；
2）高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，无法知道拷贝数，导致判断失误。

组装单个序列

1）将各个测序读数相互比较，并将它们重叠的位置组合以产生重叠群；
2）继续添加单个测序读数以构建更大和更少的重叠群；
3）最终，所有测序读数合并为每个染色体的单个共有序列 (大重叠群）。

基因表达通量检测技术转录组学研究

转录组 (transcriptome)，广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有 RNA 的总和，包括信使 RNA (mRNA)、核糖体 RNA (rRNA)、转运 RNA ( tRNA) 及非编码 RNA (non-coding RNA 或 siRNA)。现常指细胞中转录出来的所有 mRNA 的总和。
基因组-转录组-蛋白质组（genome-transcriptome-proteome) 是中心法则在组学框架下的主要表现形式。
通过特定生理条件下细胞内的 mRNA 丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。

● 基于传统的 Sanger 测序法对转录组进行研究的方法主要包括：
① 表达序列标签 (expressed sequence tag, EST) 测序技术：

在遗传学中，表达序列标签或 EST 是 cDNA 序列的短子序列。用于 EST 产生的 cDNA 通常是来自 cDNA 文库的单个克隆。
EST 测序数据是目前数量最多、涉及物种最广的转录组数据，但测序读长较短（每个转录物测定 400 ~ 500 bp)，测序通量小，测序成本较高，而且无法通过测序同时得到基因表达丰度的信息。
ESTs 可用于鉴定基因转录物，并有助于基因发现和基因序列测定。
EST 代表表达基因的部分序列。它们在数据库中可以表示为 cDNA /mRNA 序列或作为 mRNA 的反向互补物，即模板链。
EST 包含足够的信息以允许设计用于 DNA 微阵列的精确探针，然后可用于确定基因表达。

② 基因表达系列分析 (serial analysis of expression, SAGE) 技术。有人使用 SAGE 测序法，用不同转录物 3’端第一个 CATG 位点下游 14 bp 长的短标签序列来标识相应的转录物。由于标签序列较短，可以将多个标签串联测序，使 SAGE 法相对于 EST 测序在通量上大大提高。但过短的序列标签降低了序列的唯一性，即使用改进过的 LongSAGE(21 bp) 标签测序，仍然有一半的标签无法被准确注释到基因组上。

高通量测序技术 (high-throughput sexquencing) ，又名二代测序 (second-generation sequencing) 或深度测序 (deep sequencing), 可以一次性测定几十万甚至几百万条序列，是传统测序技术的一次革命，主要有 454 测序平台和 Solexa 测序平台。

基因表达水平检测

Northern 杂交：检测 RNA 表达水平
表达序列标签（expressed sequence tag，EST）测序技术
基因芯片技术 (DNA/RNA chip)
数字表达谱 DGE (Digital Gene Expression)

原位杂交技术

原位杂交 (In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为 RNA 和染色体原位杂交两大类。
RNA 原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的 mRNA 分子，两者杂交产生双链 RNA，可通过放射性标记或经殉促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。
用 mRNA 的互补链为探针进行杂交。负对照，mRNA 的同义链，无杂交信号。
荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 技术首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或 DNA 上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该 DNA 序列在染色体上的位置。
FISH 技术不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高，若用经过不同修饰的核苷酸分子标记不同的 DNA 探针，还可能在同一张切片上观察几种 DNA 探针的定位，得到相应位置和排列顺序的综合信息。

表达芯片/基因芯片

基因芯片（DNA chip），又称 DNA 微阵列 (DNA microarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。
基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的 cDNA 做探针与之杂交，确定哪些基因的表达受抑制或激活。

数字表达谱 (Digital Gene Expression)

数字基因表达谱（Digital Gene Expression Profiling, DGE）利用新一代高通量测序技术和高性能计算分析技术，能够全面、经济、快速地检测某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况。

DNA 测序技术

● 第一代测序技术 Sanger dideoxy sequencing

● 第二代测序技术

Roche 454 Pyrosequencing
lllumina Solexa cyclical base addition
ABI SOLiD sequencing by ligation

● 第三代测序技术

Single molecule sequencing
Heliscope (cyclical base addition)
Pacific Biosciences

8.2.1 第一代测序技术 Sanger dideoxy sequencing

● 第一代测序技术的特点

DNA 片断化
克隆到质粒载体上
循环测序反应
通过电泳分离
带荧光标签的读数
<1000bp/read, 96 lanes

● 原理：sanger 法测序 及 双脱氧链终止法，它采取 DNA 复制原理，通过在 DNA 复制过程中添加双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP），由于它没有 3’-OH，故不与下一个 dNTP 结合，从而使链延伸终止。ddNTP 在不同位置掺入，因而在 DNA 链不同位置发生延伸终止，产生一系列不同长度的新的 DNA 链，判断该位置的碱基类型。但是凝胶电泳的时间较长，导致 sanger 法测序通量低。

● 核糖核苷三磷酸 (NTP)、脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTP) 和双脱氧核糖核三磷酸 (ddNTP) 的结构

● DNA 合成是生成磷酸糖苷键的过程：单核苷酸 5’-磷酸基团向核酸链的 3’-OH 发起进攻。

● 目前所有测序都是以单链 DNA 为模板，在引物存在的情况下，读加上去的碱基，测序实际上是 DNA 边合成边检测的过程。

Sanger-Coulson 测序（使用单链 DNA 的链终止方法）

将待测序的样品 DNA 克隆到 M13 载体 DNA 中以产生单链 DNA (ssDNA)。
将短寡核苷酸引物（化学合成并有时标记）加入单链重组 DNA 中。
然后将 DNA 聚合酶（Klenow 大片段，无 5’-3’ 外切酶活性）加入 ³²P 标记的 dNTP 混合物分别加入四种低浓度的 ddNTP（极少量，所以会随机发生 DNA 合成终止，得到很多提前终止的产物）。注意：这里是标记 dNTP，不标记 ddNTP。
发生互补链合成。
4 种混合物电泳，测序凝胶根据其大小通过电泳分离片段。通过放射自显影观察凝胶中的 DNA 条带。
直接从凝胶中读取 DNA 序列。

Sanger 测序法的改进 (ABI 3730)

荧光标签代替放射性同位素：4 种不同的双脱氧核苷酸 (ddA，ddC，ddG 和 ddT) 被荧光标记。使用 4 种不同的荧光团，所有 4 种反应均可在同一管中进行。注意：这里是标记 ddNTP，不标记 dNTP。
毛细管电泳代替普通的平板电泳。
自动化操作。

8.2.2 第二代测序技术

原理：加碱基-读-洗 循环。先扩增，得到大量模板，然后一个个加碱基，加一个碱基就停止反应，洗掉，再换另一个碱基，再停止反应洗掉，以此循环。例如先加 A，所有能结合的就发光，洗掉保护基团，再换 T，再换 C、G…
核心技术：
① 桥式 PCR，主要用于扩大信号；
② 4 色荧光可逆终止反应，使 illumina 测序可以实现边合成边测序的技术。

8.2.2.1 Roche / 454 : Genome Sequencer FLX

● Roche / 454 的特点

实时合成测序：454 焦磷酸测序直接检测核苷酸合成时相应产物诱发的光信号，是基于合成的实时测序。
皮升滴定板中的化学发光检测
扩增：乳胶 PCR (Emulsion PCR)。
焦磷酸测序
up to 1,000,000 reads / run
on average 700 bases / read
up to 700 Mb / run

● 原理：将随机片段化后的基因组 DNA 变性成单链并稀释，让每个磁珠通过表面引物“捕获”至多一个 DNA 分子。然后每个磁珠在封闭的 乳胶小泡中 PCR 扩增至数千拷贝（模板），再次变性去除游离的 DNA 分子。富集磁珠并置于光纤载片的小槽内，以 4 种天然核苷酸为底物合成互补链。当某个新添加的核苷酸被整合到延伸的 DNA 链中，它 释放的焦磷酸被硫酸化酶转化成 ATP，荧光素酶利用这个 ATP 催化荧光素释放光信号，被光纤束连接的 CCD 检测到。

● 将一种比 PTP 板 (Pico TiterPlate) 上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链 DNA 为模板，每次反应加入一种 dNTP 进行合成反应。

● 优点：相对其它二代测序技术，主要优点是测序读长较长（平均读长 400bp，因为没有对 dNTP 做修饰，反应可以不断进行），应用于从头拼装测序等。

● 缺点：由于没有对底物核苷酸进行任何末端终止的修饰，无法准确测量同聚物（重复序列）的长度，如当序列中存在类似于 PolyA 的情况时，测序反应会一次加入多个 T，而所加入的 T 的个数只能通过荧光强度推测获得（随着反应的进行，荧光强度会逐渐衰减，所测的荧光强度不能准确反应碱基数量），这就有可能导致结果不准确。

● 碱基插入和缺失 是该方法的主要测序错误。

焦磷酸测序技术 ★★★

焦磷酸测序技术是由 4 种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。
焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板 DNA 退火后，在 DNA 聚合酶 (DNA polymerase)、ATP 硫酸化酶 (ATP sulfurytase)、荧光素酶 (luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶 (Apyrase) 4 种酶的协同作用下，将引物上每一个 dNTP 的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定 DNA 序列的目的。
焦磷酸测序技术的反应体系：反应底物、待测单链、测序引物和 4 种酶构成。
反应底物： 5’-磷酰硫酸 (adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、荧光素 (luciferin)。
反应过程：在 每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)。如果它刚好能和 DNA 模板的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的 3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸 (PPi)。在 ATP 硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 可以和 APS 结合形成 ATP, 在荧光素酶的催化下，生成的 ATP 又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。如果加入的 dNTP 不能和 DNA 模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰。反应体系中剩余的 dNTP 和残留的少量 ATP 在 Apyrase 的作用下发生降解。待上一轮反应完成后，加入另一种 dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的 DNA 序列信息。
焦磷酸测序技术的应用：研究单核苷酸多态性 (single ucleotidepolymor—phism，SNP)，遗传多态性，植物多态性分析，分子诊断细菌与病毒分型、甲基化分析、法医鉴定及药物基因组学等方面都有广泛的应用。
该技术不需要凝胶电泳，也不需要对 DNA 样品进行任何特殊形式的标记和染色，具有大通量、低成本、快速、直观的特点。

8.2.2.2 lllumina Solexa cyclical base addition

● lllumina 二代测序流程

制备单链模板
成簇 cluster：扩增模板，放大信号
测序
数据分析：读数 counts

lllumina / Solexa: 遗传分析仪的特点

实时合成测序
克隆单分子阵列
扩增：桥接 PCR
3 billions reads / run
100-250 bases / read
600 Gb / run
8 channels（一次可测 8 个样品）, ~400 mill reads / channel
荧光标签：加入的每个碱基都有荧光标记
可逆 3’-OH 阻断
11 days for 2x100bp

基于可逆终止子的测序 (Solexa)

反应过程：先随机片段化基因组 DNA，然后将各个单链模板与固相基底上的正、反向 PCR 引物 随即杂交引起互补链合成，随后经过 DNA 变性引起 邻近引物桥式扩增。不同模板生成的扩增子集群散布在基底的不同位置，形成阵列。测序过程中，测序引物与模板末端的共同接头序列杂交，在 DNA 聚合酶催化下以 4 种 3’-OH 位置加了一个可切除修饰基团的核苷酸为底物合成互补链。每一轮链延伸只有一个碱基整合，因为修饰基团会阻止下一个核苷酸整合。每个核苷酸还带有一个可切除的荧光标记基团。也就是说，每一轮链延伸，都检测一遍荧光图像信号，检测完后切除修饰基团和荧光基团，进入下一轮合成。
调用原始数据，从连续图像中依次读出每一个荧光簇的不同颜色信号：每一种颜色代表一种碱基。

lllumina 测序的基本化学原理：Sanger Sequencing 双脱氧链终止法

详见：illumina 二代测序原理及过程 ★★★
单链模板制备：加 1% NaOH。
可逆 3’-OH 阻断：阻断 3’-OH 可终止延伸，实现加一个碱基就停止反应；这个阻断过程是可逆的，能继续加下一个碱基。
对碱基修饰：带有可切除的荧光基团和修饰基团的碱基。ATCG 带不同颜色的荧光基团；可切除的修饰基团实现可逆的 3’-OH 阻断。
读取碱基的原理：模板在板上固定位置形成簇，每个簇的位置是固定的（即模板是固定的，同一个位置测的是同一条链），因此，根据每一次反应后板上的荧光变化，即可分辨加上的碱基。
Solexa 系统主要的错误出在 碱基替换。
读长受限的原因 （为什么不能像一代测序一样测 500bp 以上？)
① 修饰基团去除不完全，导致恢复 3’-OH 的反应后会产生“小尾巴”，而不是完全复原成原来的碱基，随着链的延伸，积累的“小尾巴”导致与模板结合不稳，延伸反应无法进行；
② 荧光基团去除不完全：加了一个碱基后，要加下一个碱基，需要先把前面加的碱基上的荧光基团去掉，否则影响下个碱基的读取，但往往荧光基团去除不完全，会产生背景，并随着反应进行逐渐积累加深，影响荧光信号读取的准确性。
③ 测序时经过长时间的 PCR，会有不同步的情况。比如一开始 1 个 cluster 中是 100 个完全一样的 DNA 链，但是经过 1 轮增加碱基，其中 99 个都加入了 1 个碱基，显示了红色，另外 1 个没有加入碱基，不显示颜色。这时候整体为红色，我们可以顺利得到结果。随后，在第 2 轮再加入碱基进行合成的时候，之前没有加入的加入了 1 个碱基显示红色，剩下的 99 个显示绿色，这个时候就会出现杂信号 。当测序长度不断延长，这个杂信号会越来越多，最后很有可能出现 50 个红，50 个绿色，这时信号不足以判断碱基类型；
④ 就是测序过程中 合成酶的活性 越来越不稳定，后面碱基添加出现问题。

● Deep Sequencing Technologies

Technologies	Purposes
RNA-seq (3’ end)	Gene expression profiling
ChlP-seq	DNA-protein interactions
GRO-seq	Nascent RNA production 新生 RNA
CLIP-seq	RNA-protein interactions
RASL-seq (small scale)	Splicing profiling
RASL-seq (large scale)	Large-scale target gene expression
sRNA-seq	microRNA profiling

● RNA-seq for 3’ end (MAPS)

8.2.2.3 ABI SOLiD sequencing by ligation （用得不多）

● ABI SOLiD - Sequence by Oligonucleotide Ligation with Dual-base Encoding

基板附着双碱基探针
通过剪切和适配器连接制作测序文库
将 DNA 片段连接到珠子上并乳胶 PCR 扩增
将 DNA 附着到玻片上

三个 N 核苷酸是简并碱基，可以是 A，C，T 或 G 中的任何一个。最后三个 Z 核苷酸是可以与四个核苷酸碱基中的任何一个配对的通用碱基。

● SOLiD: Sequencing ligation cycles 测序连接循环过程

● SOLiD 系统采用双碱基编码探针，片段化基因组 DNA 后用乳胶 PCR 进行扩增，这些步骤和 Roche 454 系统类似。测序引物与模板 DNA 杂交后，启动八核苷酸探针与模板的杂交。从第 n 位碱基开始，用 DNA 连接酶催化连接、采集荧光信号、切除探针后三位核苷酸及所标记的荧光标签三步循环。简并八核苷酸探针的第一位和第二位碱基决定探针的荧光标记颜色。10 次循环，产生 10 个荧光信号，对应 DNA 序列上每 5 个碱基中的前两个碱基序列。10 次循环后，变性恢复单链模板，选用不同引物，从 n-1 位碱基重新开始 10 个循环，以此类推。
● SOLiD 系统的主要错误在于碱基替换，测序通量最大，读长较短。

● SOLiD 解码序列

每种颜色表示两个碱基。
由于每种颜色代表两个核苷酸，其中每个二核苷酸单元的第二个碱基构成下个二核苷酸的第一个碱基，因此只要知道序列中的一个碱基将导致我们解释整个序列。

● ABI SOLiD/Life Technology

通过连接实时测序
珠子和乳液 PCR 在载玻片上进行
2.5 billion reads / run
35-75 bases / read
100 Gb / run
双荧光标签
8 individual channels / flowcell
2 flowcells / run
14 days for 2x50bp

3 种二代测序技术的共同特征：循环阵列方法

DNA 片断化
测序接头连接到 DNA 片段上
几种可能的方案产生 PCR 克隆阵列——扩增
具有荧光标记的核苷酸的酶促延伸
通过对阵列成像进行循环读出

二代测序平台的弱点

● 群体效应所导致的误差，因而读序短

化学反应效率不完全：聚合反应、链终止解封反应。
光信号检测误差：失去族群同步性、族群光信号失相

● 二代测序技术速率限制因素

库的构建
生物信息学，海量数据的拼接

8.2.3 第三代测序：单分子测序技术

一系列锚定的 DNA 聚合酶分子芯片
结合模板链+引物

● Heliscope 一循环添加碱基 (similar to Solexa)

HeliScope的主要错误在于碱基缺失，可以通过使模板链变性并去除、对新合成链二次测序来提高准确性。

● Pacific Biosciences (PACBIO RS) 单分子实时测序系统 (SMRT)

Pacific Biosciences
实时监测，锚定的 DNA 聚合酶
能检测 DNA 修饰 (i.e. methylation)
不需要常规的 PCR 扩增步骤，假阳性率大大减少；
利用单个 DNA 聚合酶对天然 DNA 的合成进行大规模平行的、连续的实时观察，更易发现稀有变异；
测序同时获得动力学信息，对 DNA 甲基化等碱基变化直接分析；
序列数据在几分钟之内就能产生并能实时观察，对于传染病监控和分子病理学尤为重要。
测序速度快（体现 DNA 聚合酶自身的反应速度）
测序片段长（DNA 聚合酶的延续性）
RNA 测序成为可能（固定逆转录酶）
DNA 序列甲基化的检测（甲基化修饰影响碱基掺入时间，改变信号持续时间或信号间隔时间）

8.3 功能调控与检测技术（没讲）

研究蛋白质间相互作用、蛋白质-DNA 相互作用。
科研人员还可以在活细胞内研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。

8.3.1 表达量

8.3.2 酵母单杂、双杂交系统

8.3.3 各类相互作用技术

8.3.4 标记和荧光成像技术

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【中科院】分子生物学-朱玉贤第四版-笔记-第11-12讲基因功能研究技术

文章目录

8. 基因功能研究技术

8.1 基因活性的操控技术

8.1.1 过表达 (overexpression)

8.1.2 基因定点突变 (site-directed mutagenessis) 技术

8.1.3 RNAi 技术

8.1.4 基因敲除 (gene knock-out) 技术

8.2 基因表达检测技术

8.2.1 第一代测序技术 Sanger dideoxy sequencing

8.2.2 第二代测序技术

8.2.2.1 Roche / 454 : Genome Sequencer FLX

8.2.2.2 lllumina Solexa cyclical base addition

8.2.2.3 ABI SOLiD sequencing by ligation （用得不多）

8.2.3 第三代测序：单分子测序技术

8.3 功能调控与检测技术（没讲）

8.3.1 表达量

8.3.2 酵母单杂、双杂交系统

8.3.3 各类相互作用技术

8.3.4 标记和荧光成像技术

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8.1 基因活性的操控技术

8.1.1 过表达 (overexpression)

8.1.2 基因定点突变 (site-directed mutagenessis) 技术

8.1.3 RNAi 技术

8.1.4 基因敲除 (gene knock-out) 技术

8.2 基因表达检测技术

8.2.1 第一代测序技术 Sanger dideoxy sequencing

8.2.2 第二代测序技术

8.2.2.1 Roche / 454 : Genome Sequencer FLX

8.2.2.2 lllumina Solexa cyclical base addition

8.2.2.3 ABI SOLiD sequencing by ligation （用得不多）

8.2.3 第三代测序：单分子测序技术

8.3 功能调控与检测技术（没讲）

8.3.1 表达量

8.3.2 酵母单杂、双杂交系统

8.3.3 各类相互作用技术

8.3.4 标记和荧光成像技术

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