第 9 讲重组 DNA 克隆技术

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6. 重组 DNA 克隆技术
- 6.1 DNA 克隆常用的酶
- 6.2 载体 vector
- - 6.2.1 克隆载体
  - 6.2.2 表达载体

6. 重组 DNA 克隆技术

设想你是一位 1972 年的遗传学家，想从分子水平研究真核基因的功能。例如，你对人生长素 (hGH) 基因的结构和功能感兴趣，那么该基因的序列是什么？其启动子是怎样的？哪些蛋白或者转录因子与该基因相互作用？基因发生了什么变化导致垂体功能减退性侏儒症？如何得到足量的基因进行研究？

基因克隆技术，又叫重组 DNA 克隆技术，能将外源 DNA 与载体 DNA （小的细菌 DNA 或者噬菌体 DNA 等）连接起来，并将这些重组分子转入宿主细胞（细菌等），通过宿主细胞的大量扩增复制外源 DNA。
重组 DNA 克隆技术主要包括 DNA 分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和 PCR 扩增等，是分子生物学研究的核心技术。

克隆

在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有 相同基因型 的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子 (monozygotic twins) 便是属于同一克隆。
在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞 (progenitor cell) 分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。
在 分子生物学 上，人们把将外源 DNA 插入具有复制能力的载体 DNA 中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。

基因工程

基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行 持续稳定的繁殖和表达。
基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。
examples：转基因番茄、转基因小鼠

★ 限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶能够识别 DNA 上的特定碱基序列并从这个位点切开 DNA 分子。
第一个核酸内切酶 EcoRⅠ 是 Boyer 实验室在 1972 年在大肠杆菌中发现的，它能特异性识别 GAATTC 序列，将双链 DNA 分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。
1978 年诺贝尔生理学或医学奖共同授予 Werner Arber, Daniel Nathans 和 Hamilton O. Smith, 表彰他们“发现限制酶及其在分子遗传学问题上的应用”。

★ 克隆载体 (Cloning vector)

重组后的 DNA 只有将它们连接到具备自主复制能力的 DNA 分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。
具备自主复制能力的 DNA 分子就是分子克隆的载体 (vector)，分为克隆载体和表达载体。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。

● Cloning in E.coli ：酶切 → 连接 → 转化 → 筛选 → 扩增

DNA 导入细胞的过程：原核生物叫转化 transformation，真核生物叫转染 transfection。
细菌有质粒不相容的特性，只要有一个碱基不同，就不会存在于同一个克隆中。
质粒的不相容性（plasmid Incompatibility）指在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能在同一宿主细胞系中稳定共存的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存。

6.1 DNA 克隆常用的酶

★ Restriction Endonucleases（限制性内切酶）

限制性识别位点 (Restriction-recognition sites) 是由各种限制性内切核酸酶识别和切割的短 DNA 序列。
三种类型：
根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型：第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
- Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主 DNA 的甲基化，又催化非甲基化的 DNA 的水解。
- Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的 DNA 的水解。
- Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。

● 限制性内切酶酶切位点是具有中心对称的 回文序列。

回文序列：如果一个（单链）核苷酸的序列和它的反向互补链的序列一样，那么这个核苷酸序列就是回文序列。较长的回文结构容易转化成发夹结构，可能有助于DNA与特异性DNA结合蛋白结合。

● 切割 DNA 产生粘性末端或平末端

平末端 Blunt ends: paired base sequences at the ends of DNA.
粘性末端 Sticky ends: unpaired base sequences at the ends of DNA. 5’突出端、3’突出端
切割后产生 2 个末端基团：5’-Pi 和 3’-OH

★ Isocandamers 同尾酶：产生相同的末端。

2 个同尾酶产生的片段连接后大多数 无法再次被切割。
AgaⅠ（A/CCGGT）和 AvaⅠ(C/CCGGG)。
所有产生平末端的酶都是同尾酶。
参考搜索：常见同尾酶
可以再次切割的少数同尾酶，如 BamHⅠ （G/GATCC）和 BglⅡ (A/GATCT) 可以被 Sau3AⅠ（5’▼GATC3’）切割。
同尾酶克隆：目的基因内部有酶切位点时，可以引入同尾酶来获得可以配对的粘性末端。

★ 细菌中 DNA 甲基化修饰系统
Q: 细菌能切割入侵的病毒 DNA, 为什么不破坏宿主细胞自身的 DNA?

DNA 甲基转移酶 (MTases) 普遍存在于原核和真核生物中，能将 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 上的甲基转移至腺嘌呤 A 或者胞嘧啶 C 碱基上，形成甲基化。
甲基化修饰的位点不会被限制性内切酶切割。限制性酶切位点可能由于与甲基化位点有重叠而无法切割。因此在质粒构建设计切位点时，要充分考虑到这种情况。
每一个限制性酶切位点都有对应的甲基化酶切位点。
E.coli 的 Dam 甲基化（G6mATC）, Dcm 甲基化（C5mCA/TGG）
Dam 甲基化酶可将 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位点进行甲基化修饰；
Dcm 甲基化酶可将 CCAGG 和 CCTGG 序列中胞嘧啶 C 5 位点进行甲基化修饰。
dcm^- E.coli strain: 甲基化酶缺陷型菌株，不在大肠杆菌中甲基化 DNA，以方便地消化从大肠杆菌中提取的 DNA。
endA^- E.coli strain: 甲基化酶缺陷型菌株，保护外源 DNA 免受宿主细胞限制性内切核酸酶的消化。
当 DNA 中酶切位点由于 Dam 或 Dcm 甲基化修饰而无法切割时，可将 DNA 转化至 dam^-/dcm^-菌株（如 GM2163)，重新抽提得到的去甲基化的质粒。
哺乳动物 CG 甲基化（5mCG）
真核生物中存在 CpG 甲基转移酶，可将甲基基团转移至胞嘧啶 C 残基上的 C5 位点，可遗传，有组织特异性，调控基因的表达。

★ DNA Ligases（DNA 连接酶）

DNA 连接酶能把不同的 DNA 片段连接成一个整体
EcoRⅠ （5’▼GAATTC3’）产生的粘性末端 AATT 连接效率低（两个氢键连接，热力学不稳定），所以连接时应该低温（4℃过夜）
NotⅠ（▼GCGGCCGC）末端 GC 含量高，连接效率高，16℃即可（温度越高连接酶的活性越高）
参考搜索： 常用酶切位点

★ T4 DNA Ligase

ATP 依赖性催化 dsDNA 或 RNA 中 5-Pi 和 3’-OH 之间磷酸二酯键的形成。
在 DNA 连接中消耗两个 ATP 分子。（一个 ATP 填一个缺口）

● 用于连接的 DNA 末端

用两种限制性内切核酸酶切割，产生相容的突出端。用相同的酶或同尾酶切割产生的。
用两个产生平端的限制性内切核酸酶切割。
切割后突出端接着填充或剪切以产生平端。（利用聚合酶 5’-3’的活性填平，或利用外切酶活性把突出端切除）

● 碱性磷酸酶 的去磷酸化提高平末端 DNA 连接的效率

不到万不得已，不用平末端：都是平端，无法确定方向；载体自身的平端会连接环化；片段越小，转染效率越高，导致载体自身更容易进入宿主细胞。
碱性磷酸酶的原理：将载体末端的磷酸基团去磷酸化，变为羟基，防止载体自连。
小牛肠道来源的碱性磷酸酶 (CIP) 不好，有切割活性，会切得很乱
虾碱性磷酸酶 (SAP) 更好用

● T4 多核苷酸激酶（Polynucleotide Kinase, T4）磷酸化 DNA 5’-OH

合成的 DNA 序列两端一般只有羟基，没有磷酸基团，无法连接
需要在 5’加磷酸基团，用 T4 Polynucleotide Kinase 即可产生 5’-Pi

TA 克隆

TA 克隆提高钝端 DNA 连接的效率
TA 克隆：把PCR片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3’加上A。
T-载体 ——载体上加 3’-T（只加核苷酸 T 和酶）
目的片段加 A（PCR 扩增目的片段时，Taq 酶自动加 3’-A）
参考资料（b站）：
分子克隆方法/TA克隆 TOPO克隆【基础干货】
分子克隆方法| Golden Gate/ Gateway/ Infusion

多片段克隆

吉布森组装 (Gibson assembly)：重叠接头法，用于拼接多个线性 DNA 片段，并将目的 DNA 插入载体中。在 DNA 片段的末端加上同源片段（通过 PCR 法加上）。
Hot Fusion 热融合
In-Fusion 组装 痘病毒 (poxvirus) DNA 聚合酶的 3’-5’核酸外切酶活性

INFUSION 酶 能够识别线性化的 DNA 片段 5’-3’末端任意 16 碱基，使其形成粘性末端。

● 一步克隆多个片段

不需要限制性内切酶
不需要连接酶
克隆片段数量<5
用于定点突变

6.2 载体 vector

克隆载体：质粒 plasmids, 噬菌体 phages, 粘粒 cosmids, 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosomes, YAC) ，噬粒 ( phagemid)
应用：扩增插入 DNA，研究启动子的特性，表达克隆的基因，产生各种融合蛋白。
穿梭载体可以在多种类型的宿主细胞中增殖。
克隆载体、表达载体

★ 质粒

大肠杆菌克隆载体：pBR322, pUC18/19 (500-700 copies)
大肠杆菌表达载体：pET system
高拷贝数，易于克隆，插入片段 <10kb
- ori：复制起始位点
- amp：氨苄青霉素抗性基因（筛选用）
- lacZ：融合标签（筛选、纯化用）
- Polylinker：位于标签前，多克隆位点（有很多酶切位点的短序列）
- P_T7：T7 Promoter 用于表达蛋白的调控元件

6.2.1 克隆载体

用于复制的 ori 序列
用于筛选的抗药性基因 amp
用于 DNA 插入的多克隆位点 (MCS)
多克隆位点位于 lacZ⁺基因内部，通过产物颜色检测目的基因是否插入（导致阅读框变化）：lacZ⁺ 为蓝色，lacZ^- 为白色（蓝白筛选）

基因克隆的载体

pSC101 质粒载体：是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有 1~2 个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取 pSC101 DNA, 产量很低。
ColE1 质粒载体：松弛型复制控制的多拷贝质粒。
一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体 DNA 的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。松弛型质粒 DNA 却继续复制数小时，使每个寄主细胞中 CoIE1 质粒的拷贝数达到 1000~3000 个，占细胞总 DNA 的 50%左右。

ColE1 质粒 DNA 复制起始部位调控机制

→ 前体 RNA(RNA2) 的转录起始于复制起点上游，需经 RNaseH 加工后产生有 555 个核苷酸的引物，起始 DNA 合成。
→ RNA 1（可以认为是 microRNA）在 RNA 2 的 5’末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止 RNaseH 加工 RNA2, 使其不能转化为有活性的引物，阻碍 RNA2 的复制起始。
→ 没有 Rop 蛋白，RNA 1 基因就不能起始转录。
pBR322 质粒载体：现在用得少，Amp^r+四环素（tet^r）调控的质粒。
优点是具有较小的分子量 (4363 bp)。能携带 6-8 kb 的外源 DNA 片段，操作较为便利。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积 1000~3000 个拷贝，便于制备重组体 DNA。

pUC 质粒载体

来自 pBR322 质粒的复制起点 (ori)
氨苄青霉素抗性基因 (amp^r)
大肠杆菌β-半乳糖酶基因 (lacZ) 启动子及编码α-肽链的 DNA 序列。特称为 lacZ’基因
位于 lacZ’基因 5’端的一段多克隆位点 (MCS)，外源基因插入破坏 lacZ’基因功能
更小的分子量和更高的拷贝数。在 pBR322 基础上构建 pUC 质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多。pUC8 为 2750bp, pUC18 为 2686bp。由于缺失 rop 基因，pUC 质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达 500~700 个拷贝。
具有多克隆位点 MCS 区段，可以把具两种不同粘性未端（如 EcoRI 和 BamHI) 的外源 DNA 片段直接克隆到 pUC8 质粒载体上。

蓝白克隆筛选

LacZ 编码β-半乳糖苷酶氨基端 146 个氨基酸的 α-肽，IPTG （异丙基-B-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，所合成的 β-半乳糖苷酶α-肽与宿主细胞编码的缺陷型 β-半乳糖苷酶互补，产生有活性的 β-半乳糖苷酶，水解培养基中的底物 X-gal (5-溴-4-氯-3-引哚-β-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯躬哚。
含 X-gal 培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组 DNA 分子的菌落为白色（错框插入 DNA 分子，破坏 LacZ）。
挑白色克隆菌落扩增培养，提取质粒 DNA，检测验证。

使用两种限制性内切核酸酶，可以将 DNA 片段沿一个方向克隆到载体中。
◆ 方向性：表达载体，要保证沿着启动子的方向读框
◆ 同框

只用一种限制性内切酶存在的问题：
① 自身环化：需用 SAP 脱磷
② 没有方向性：尽可能多挑选克隆鉴定其正反。找一个内切酶，可以在目的基因上切一刀，在载体上切一刀，产生的片段大小不一样，电泳即可分辨。

6.2.2 表达载体

用于复制的 ori 序列
用于筛选的抗药性基因
用于 DNA 插入的多克隆位点 (MCS)
启动子 (T7)，RBS （核糖体结合位点），转录终止子
N-或 C-末端融合标签
蛋白酶切割位点

pET 表达载体

参考搜索：pET载体
T7 启动子的表达受 lac 操纵子控制。
T7 溶菌酶是 T7 RNA 聚合酶（内源）的天然抑制剂。
Ori：The origin of replication，由复制起始位点和相关调控元件组成，pET-28a(+) 中的复制子属于松弛型中低拷贝型复制子，目标蛋白的高表达会对宿主菌造成较大的压力，所以表达载体的拷贝数通常较低。
Kan：编码氨基糖苷磷酸转移酶，使质粒产生卡那霉素抗性，用于筛选培养过程中含有目标质粒的宿主菌。
Rop：编码 ROP 蛋白，ROP 蛋白是一种复制调控蛋白，将质粒的拷贝数维持在 15-20，该元件缺失会导致质粒拷贝数升高。
乳糖操纵子元件——lacⅠ promoter+ lacⅠ表达 LacⅠ阻遏蛋白，该阻遏蛋白形成四聚体可以与 Lac Operator 结合，使 T7 RNA 聚合酶无法与启动子结合以及向下转录，从而关闭下游基因的表达。乳糖类似物 IPTG 可与阻遏蛋白结合解除对下游基因表达的抑制，使下游基因正常表达。
载体序列
T7 promoter：来源于 T7 噬菌体，受控于 T7 RNA 聚合酶的启动子，是当今大肠杆菌表达系统的主流。强大的 T7 启动子完全专一受控于 T7 RNA 聚合酶，而高活性的 T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合酶快 5 倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过 T7 表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。
6×His(His-tag)：由六个组氨酸组成的标签，在 MCS 区 C 端和 N 端各有一个，编码 6 个连续的 His，可以采用固定化金属螯合层析 IMAC 对重组蛋白进行分离纯化。
T7 tag：T7 噬菌体编码的蛋白 p10 前导序列的 11 个氨基酸，序列为 MASMTGGQQMG，该标签可以被 T7 tag 标签抗体特异性识别。
MCS：多克隆位点区域。（NdeⅠ，NcoⅠ罕见位点，一般基因中不切）
T7 terminator：受控于 T7 RNA 聚合酶的终止子。
pET 表达菌株

表达标签

与目的蛋白一起形成融合蛋白，便于分离纯化。

★ 标签的选择需考虑：

标签大小
可溶性
纯化亲和力

共表达载体（多顺反子载体）

同时表达多个蛋白。

● 多顺反子—— IRES 元件

IRES 元件充当另一个核糖体募集位点（IRES 可结合核糖体，结合后起始下游基因的翻译），从而导致来自单个 mRNA 的两种蛋白质的共表达。
缺点：大 (500-600 bp)，表达两个以上基因不可行（只能表达 2 个基因），下游顺反子表达效率较低。

● 2A Peptides

可以表达两个以上基因。
2A 肽使核糖体跳过 2A 元件 C-末端的肽键合成。
2A 肽 是来源于病毒的短肽（〜18-25 个氨基酸），它们通常被称为 “自我剪切”肽，能使一条转录产物产生多种蛋白。2A 肽并不是完全的“自我剪切”，而是通过使核糖体跳过 2A 元件 C-末端的甘氨酸 G 和脯氨酸 P 肽键的合成而发挥作用，最终导致 2A 序列末端和下游产物分离。其中，上游蛋白的 C 端将会添加一些额外的 2A 残基，而下游蛋白的 N 端将会有额外的脯氨酸。目前有四种常用的 2A 肽，分别是 P2A，T2A，E2A 和 F2A，来源于四种不同的病毒。
缺点：2A 肽的自我切割并不是 100％有效的，其表达效率会受上下游 ORF 序列的影响。
参考 1：IRES 与 2A 肽 (P2A/T2A/E2A/F2A)
参考 2：载体构建中 IRES 和 P2A 的选择

载体中克隆的 DNA 的近似最大长度

以上载体做法与质粒一样，只是组成和插入片段不同，要导入载体都需要酶切和连接。

★ λ 噬菌体

噬菌体载体：λ 载体
插入片段：5-20kb
应用： cDNA 文库构建，基因组文库
优点：λ-噬菌体载体在体外包装成噬菌体颗粒后，可以高效转染大肠杆菌，感染宿主细胞的效率几乎可达 100%，而质粒 DNA 的转化率只有千分之一。
噬菌体是对细菌病毒的统称，而 λ噬菌体是感染大肠杆菌的溶原性噬菌体，在感染宿主后可进入溶原状态，也可进入裂解循环。（染色体 DNA 上整合有噬菌体基因组的宿主细胞，不会因为噬菌体感染而发生裂解的这种现象称为溶原现象 (lysogenesis)，整合有噬菌体基因组的宿主细胞叫做溶原菌 (lysogen)。）
在噬菌体颗粒内，基因组 DNA 呈现线性，其两端的 5’末端各带有 12 个碱基的互补单链（黏性末端）。
当 λ 噬菌体 DNA 注入宿主细胞后，便通过黏性末端配对形成双链环状 DNA 分子，这种由黏性末端结合形成的双链区段称为 cos 位点，这是将入 DNA 包装到噬菌体颗粒中所必需的 DNA 序列。
野生型的 λ 噬菌体的基因组大而且复杂，不适于直接作为基因克隆的载体。

λ 噬菌体的改造
● 针对基因组过大——去掉对裂解生长非必需的 DNA 片段，增大外源 DNA 的装载量，最大装载量可达 23kb。
● 针对酶切位点过多——采用定点突变的方法每种酶仅保留 1-2 个位点，在非必需区引入合适的限制性酶切位点，便于外源 DNA 片段的插入。
● 针对λ 噬菌体缺乏合适的遗传选择标记——在非必需区域引入了带有多克隆位点的 lacZ 基因，通过组织化学的方法进行重组子的筛选。
● 针对生物安全性——在λ基因组的裂解周期必需的基因内引入无义突变后，λ 噬菌体只能在具有无义突变抑制基因的大肠杆菌中存活。

● λ 噬菌体载体的主要类型：

改造后的入载体可分为插入型和取代型两大类。
插入型载体 中只具有一个可供外源 DNA 插入的克隆位点，外源 DNA 克隆到插入型λ载体上，会导致插入失活效应，又可分为免疫功能失活和大肠杆菌β半乳糖苷酶失活两种亚型，分别以 λgt10 和 λgt11 为代表。
取代型载体具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA 区段可以被外源插入的 DNA 片段所置换。以 λEMBL3 和 λEMBL4 为代表。

Cosmids（粘粒）

粘粒：一种含有 1 或 2 个λ 噬菌体 cos 位点的杂交质粒。
插入 DNA <48 kb。
像质粒一样将 DNA 克隆到载体中，通过噬菌体颗粒将 DNA 导入细菌细胞，像质粒一样繁殖。

Phagemids（噬粒）

质粒和丝状噬菌体的组合。
包含用于双链复制的复制 ori，以及用于实现单链复制和包装到噬菌体颗粒中的 f1 ori。
在 M13 或 f1 辅助噬菌体的存在下，将产生单链 DNA。
噬菌粒是小质粒（3-4kb），因此它们可以接受比基于 M13 的载体（~50kb）更大的 DNA 插入物。

YAC 酵母人工染色体

真核生物染色体复制需要：两个端粒（telomeres），着丝粒（ centromere）和复制起点
YAC 包含：端粒（telomeres，TEL），着丝粒 (centromere，CEN），选择标记（TRP1 和 URA1），自主复制序列（autonomously replicating sequence，ARS）, 多克隆位点。
YAC 可携带高达 1000kb 的 DNA 片段，用于创建基因组作图（物理图谱）

穿梭载体 Shuttle vectors

由人工构建的具有原核和真核两种不同复制起点和选择标记，可在不同的寄主细胞内存活和复制的质粒载体。
克隆构建在大肠杆菌中完成后，利用穿梭载体将外源基因导入真核细胞。

杆状病毒（Baculovirus）——昆虫表达系统

杆状病毒是感染昆虫细胞系的杆状形状的病毒。
杆状病毒具有 90-180kb 大小的双链环状 DNA 基因组。

本讲总结
①克隆基本流程；
②连接酶；
③载体：克隆载体＋表达载体；
④质粒；
⑤常见质粒元件；
⑥蓝白筛选；
⑦穿梭载体；
⑧不同表达系统中载体的基本元件

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