转录因子VaERF16和VaMYB306相互作用增强葡萄对灰霉病的抗性

文章信息

题目：The transcription factors VaERF16 and VaMYB306 interact to enhance resistance of grapevine to Botrytis cinerea infection

刊名：MOLECULAR PLANT PATHOLOGY

作者：Yanxun Zhu,Xiuming Zhang et al.

单位：Northwest A&F University

日期：12 July 2022

摘要

Botrytis cinerea是一种感染葡萄 ( Vitis vinifera ) 的真菌；确定宿主的抗性机制对葡萄产业非常重要。在这里，我们报告了来自中国野葡萄（'双优' ）的乙烯反应因子（ERF）家族（ VaERF16 ）中的一个转录因子在灰霉病感染和对激素乙烯、茉莉酸甲酯治疗的反应。VaERF16在拟南芥中的异源过表达显着增强了对灰霉病的抗性。酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀测定表明 VaERF16 与 MYB 家族转录因子 VaMYB306 存在相互作用。VaERF16或VaMYB306在葡萄叶中的过表达增加了对灰霉病的抗性，并引起防御相关基因PDF1.2的上调，该基因编码一种防御素样蛋白。相反，任一基因的沉默导致对B. cinerea的易感性增加。酵母单杂交和双荧光素酶测定表明，VaERF16通过直接结合其启动子中的 GCC 框来增加 VaPDF1.2 的转录水平。值得注意的是，单独的 VaMYB306 不与VaPDF1.2启动子结合，但 VaERF16-VaMYB306 转录复合物导致 VaPDF1.2 的转录水平更高，这表明蛋白质通过它们的相互作用发挥作用。

技术路线

主要结果

2.1 VaERF16的序列分析和表达模式

之前通过 AP2 结构域 (PF00847) 的隐马尔可夫模型 (HMM) 鉴定了 113 个葡萄 ERF 家族基因，并检查了来自V. vinifera和V. amurensis的 ERF 基因的转录水平以响应灰霉病感染。ERF16包含一个保守的 AP2 结构域，其表达由B. cinerea感染诱导。为了进一步了解ERF16在葡萄病原体抗性中的潜在功能，我们克隆并测序了来自双优V. amurensis叶子的全长VaERF16 cDNA 序列。发现VaERF16包含一个 777bp 的开放阅读框，编码一个 259 个氨基酸的蛋白质，预测的分子量为 28.72 kDa。VaERF16位于 5 号染色体上（图 1a）。VaERF16 具有保守的 AP2 结构域（氨基酸残基 89-152），与V. vinifera的 VvERF16 仅相差三个氨基酸（图 1b）。ERF 家族已在多种植物中发现，例如拟南芥、烟草、大豆、苹果、番茄、棉花和苜蓿。因此，我们从这些植物中选择了 7 个VaERF16同源基因进行序列比对。结果表明，VaERF16与棉花GhERF16 具有高度序列相似性（图 1c，d）。使用 SWISS-MODEL 数据库对 VaERF16 的三维结构预测) 揭示了一个长的 C 末端 α-螺旋和一个三链反平行 β-折叠 (从 β1 到 β3)，这与先前报道的拟南芥AP2 结构域结构相似，表明高度的进化保守性（图 1e）。通过在本氏烟草中异源表达 VaERF16-黄色荧光蛋白 (YFP) 融合蛋白来研究 VaERF16 的亚细胞定位。产生的荧光信号与核标记（DAPI) 共定位，表明 VaERF16 是一种核蛋白（图 1f）。此外，酵母双杂交 (Y2H) 试验表明 VaERF16 具有转录激活活性，因为表达 VaERF16-BD 蛋白的酵母菌株生长良好，并且在 SD/-Trp/X- 上生长时显示GAL4报告基因的激活。α-Gal/aureobasidin A (AbA) 培养基（图 1g）。

2.2 VaERF16在拟南芥中的异源表达增强了对B. cinerea的抗性

为了进一步表征VaERF16在抗病性中的作用，生成了过表达 VaERF16 的拟南芥品系。用B. cinerea接种表达VaERF16（图 2b）以及 Col-0（野生型 [WT]）的三个转基因 T 3代系。WT 植物的叶子在 3 dpi 时变黄并显示出比转基因株系更大的病变直径（图 2a，c ），对感染叶片中灰霉病菌定植的量化显示转基因株系中的定殖较少（图2d）。我们使用二氨基联苯胺 (DAB) 染色测量了 H2O2积累。与WT植物相比，转基因株系在接种后72小时（hpi）显示出更少的ROS积累（图 2e）。还量化了内源性 H2O2含量，结果表明，在 72 hpi 的 WT 系中，体内 H2O2含量较高（图2f）。此外，台盼蓝测定表明，转基因株系在 72 hpi 时比 WT 植物具有更少的细胞死亡（图 2e）。显微镜观察显示，在 24 hpi，在 WT 叶片上已经发现B. cinerea的分生孢子，而在转基因品系中几乎没有观察到真菌生长。从 24 到 72 hpi，在 WT 叶片上出现了许多带有菌丝体和较长胚管的蔓延病灶，而在转基因株系的叶片上观察到较少的分生孢子和较短的胚管（图 S2 )。

为了研究与植物激素信号传导的关系，我们分析了两个 SA 响应基因（AtPR1和AtNPR1）和四个 JA/ET 响应基因（AtPDF1.2、AtLOX3、AtPR3和AtPR4）的转录水平。观察到AtPDF1.2、AtPR3和AtPR4的转录水平在 72 hpi 时高于 WT 植物，而AtLOX3的转录水平在 24 hpi 时增加，在 48 hpi 时达到峰值，但在 72 hpi 时下降。AtNPR1的转录水平在感染的早期阶段上调并在 72 hpi 时降低。相比之下，AtPR1的转录水平在早期没有表现出明显的诱导，但在 48 和 72 hpi 时显着增加（图 3）。

2.3 VaERF16 与 VaMYB306 相互作用

防御反应期间 JA 和 ET 信号之间的相互作用是协同的，ERF 蛋白特异性结合含有 GCC 框的 DNA 序列，这些序列通常存在于 JA 和 ET 诱导防御基因的启动子中。因为VaERF16在 JA 和 ET 信号通路中起重要作用（图 S1 b、d 和 3），我们推测它也可能作为PDF1.2的调节剂。为了测试这一点，从双优基因组 DNA 序列中克隆了VaPDF1.2启动子。VaPDF1.2启动子序列包含一个 GCC 框 (AGCCGCCA) 和另一个可能被 VaERF16 识别的预测结合位点 (AGCAGCCC) (图 5a )。然后我们进行了酵母单杂交试验以确定 VaERF16 是否可以与VaPDF1.2启动子结合，使用空载体作为阴性对照。在确定最低抑制 AbA 浓度 (200 ng/ml) 后（图 5b），观察到VaERF16即使在低浓度下也直接与VaPDF1.2启动子结合，而VaMYB306则没有（图 5c，d）。然后使用双荧光素酶测定来确定 VaERF16-VaPDF1.2 相互作用是否导致基因激活或抑制。将VaPDF1.2启动子克隆到 pGreenII 0800-LUC 载体中，并与VaERF16、VaMYB306或VaERF16 / VaMYB306的组合共同转化到烟叶中（图 5e）。我们观察到 VaERF16 诱导 VaPDF1.2 的积累转录本，反式激活增加了近 2.5 倍。值得注意的是，VaERF16 和 VaMYB306 的组合在体内上调了 VaPDF1.2 的转录水平（图 5f）。这些结果表明，VaERF16 可以直接与VaPDF1.2的启动子结合，并且 VaERF16-VaMYB306 转录复合物通过增加VaPDF1.2的转录水平有助于病原体防御。

2.4 瞬时VaERF16和VaMYB306过表达增强了两种易感葡萄品种的灰霉病菌抗性

为了更好地了解VaERF16和VaMYB306如何在病原体反应中发挥作用，我们分别将这两个基因瞬时转化到易感葡萄（Red Globe 和 Thompson Seedless）叶子，并用含有B. cinerea菌丝体接种它们。在浸润后 48 小时分析VaERF16和VaMYB306的转录水平。它们比未转化的叶子高 2-3 倍，表明VaERF16和VaMYB306成功过表达（图 6g和S6g）。由灰霉病菌引起的病变，在 WT 叶片上，空过表达 (OE) 载体对照叶片显着大于来自VaERF16 OE 和VaMYB306 OE 植物的叶片。此外，WT 叶和空载体对照叶已完全腐烂，并在 72 hpi 时被B. cinerea菌丝体覆盖（图6a-d和S6 a-d）。在 24 hpi 在 WT 和空载体对照叶上观察到B. cinerea的菌丝，而在VaERF16 OE 和VaMYB306 OE 叶子上仅观察到很少的分生孢子。此外，在 72 hpi 时，与两个品种的对照相比，在VaERF16 OE 和VaMYB306 OE 叶片上发现的菌丝较少（图6e和S6 e)。此外，受感染叶片中灰霉病菌生物量的定量显示， VaERF16 OE 和VaMYB306 OE 叶片中的定殖较少（图 6f和S6f）。PDF1.2的转录水平在 24 hpi 增加并在 72 hpi 达到峰值，而Thompson Seedless 中的灰霉病感染（图 S6 h）在 WT 植物和空载体对照植物中没有观察到这种变化。

2.5 VaERF16和VaMYB306的瞬时沉默降低了两个抗病葡萄品种对灰霉病菌的抗性

研究表明，'菊梅桂'对灰霉病具有高度抗性。因此，我们接下来使用 RNA 干扰 (RNAi) 方法来抑制瞬时转化的菊美桂和双优叶中VaERF16和VaMYB306的转录水平。VaERF16的转录水平降低至菊梅贵叶中的 30%，VaMYB306的水平降低至 70%（图 S8 b）。在双优叶中， VaERF16的转录水平降低至非转基因水平的 30%，VaMYB306的转录水平降低至非转基因水平的 50%（图 S8 a)。接种B. cinerea后, VaMYB306 -RNAi 叶片在 24 hpi 时坏死, VaERF16 -RNAi 叶片上的病变远大于 WT 植物叶片上的病变, 特别是在 72 hpi 时（图 7a-c和S7 a-c）。此外，与 WT 菊梅桂叶相比，在VaERF16 -RNAi 和VaMYB306 -RNAi 叶片上观察到更多的菌丝体，尤其是在 72 hpi 时（图 S7 d）。在VaERF16 -RNAi 和VaMYB306上发现大量菌丝体-RNAi在24和48 hpi叶片，而同期双优WT叶片上发现的B. cinerea分生孢子较少（图 7d）。此外，在 72 hpi 时，WT 叶片上的B. cinerea生物量低于VaERF16 -RNAi 和VaMYB306 -RNAi 叶片，表明VaERF16 -RNAi 和VaMYB306 -RNAi植物对B. cinerea的疾病易感性增强（图 7e和S7e）。此外，PDF1.2和ERF20的转录水平在两个品种中相似，但在VaERF16 -RNAi 和VaMYB306 -RNAi 叶子与 WT 叶子在不同感染时间点的比较（图 7f和S7f）。总之，这些结果与观察到的VaERF16 OE 或VaMYB306 OE 叶的抗性增加以及VaERF16 -RNAi 或VaMYB306 -RNAi 叶对B.cinerea的敏感性一致，表明VaERF16和VaMYB306有助于对该病原体的抗病性。

结论

本文提出了一个模型，其中VaERF16增强了对灰霉病的抗性。灰霉病通过 SA 和 JA/ET 信号通路。VaMYB306 通过与 VaERF16 相互作用参与抗病性，VaERF16 形成复合物并与防御相关基因启动子中的元件结合，包括VaPDF1.2启动子中的 GCC 框（图 8）。我们的数据为ERF基因响应病原体接种的功能和机制提供了新的见解，并证明了通过育种或基因组修饰策略增强葡萄树抗病性的机会。

原文获取

原文链接：

https://bsppjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/mpp.13223

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