microRNA172靶向APETALA2以调节苹果中的类黄酮生物合成

文章信息

题目：

microRNA172 targets APETALA2 to regulate flavonoid biosynthesis in apple (Malus domestica).

刊名：Horticulture Research

作者：Tiyu Ding, Jia-Long Yao et al.

单位：Zhengzhou Fruit Research Institute

Published online：2022 Jan 28.

摘要

MicroRNA172 ( miR172 ) 在调节多种植物发育过程中发挥作用，包括开花、果实发育和结瘤。然而，其在调节类黄酮生物合成中的作用尚不清楚。在这项研究中，过表达 miR172的转基因苹果植物在各种组织类型中显示出花青素积累的减少。这种降低与APETALA2同源物 MdAP2_1a（一种miR172靶基因）、 MdMYB10和 MdMYB10 靶点的表达降低一致。过表达MdAP2_1a的转基因烟草植物中花瓣花青素积累增强，以及用 MdAP2_1a病毒诱导的基因沉默构建体转染的苹果和樱桃果实中花青素积累减少，支持了其调节花青素生物合成。我们证明 MdAP2_1a 可以直接与酵母和烟草中MdMYB10的启动子序列结合，并增强 MdMYB10启动子的活性。在拟南芥中， miR172的过表达在含有 7% 蔗糖的培养基上培养的小植株中，类黄酮（包括花青素和黄酮醇）浓度和 RNA 转录本丰度降低。通过使用MdAP2_1a的同义突变体可以部分恢复花青素基因的花青素含量和 RNA 丰度，该突变体在 mRNA 水平上丢失了miR172靶序列，但使用 WT MdAP2_1a不能恢复。这些结果表明miR172通过抑制正调节 MdMYB10 的 AP2 转录因子的表达来抑制类黄酮的生物合成。

技术路线

主要结果

3.1 miR172的过表达减少了多种苹果组织中的红色

为了检查miR172的功能，用基因构建体产生了六个独立的苹果转基因植物系，以过度表达 miR172，并在温室中生长至成熟。除了在我们之前的研究中发现减少的果实大小表型外，我们还发现这些转基因植物中的类黄酮积累也减少了。在对过表达miR172的转基因植物（miR172OX）进行检查后，几种植物组织类型中的红色水平似乎降低了。（图1）。在组织培养条件下，当培养基的蔗糖浓度升高至 7% 时，WT 植物的离体枝条的叶子显示出红色，而当植物在含有标准浓度 3% 蔗糖的培养基上生长时未观察到这种红色。在测试的三个独立miR172OX系的叶子中没有观察到蔗糖诱导的花青素生物合成（图 1a、b、c）。在温室条件下，四个独立转基因植物的幼茎或叶柄或可育转基因植物的 PCR 阳性幼苗上未观察到红色，但在 WT 对照植物的幼茎和叶柄上很明显。图 1d）。在miR172OX植物的成熟果皮中也观察到红色的减少（图 1e）。miR172OX植物的果皮表现出强烈的赤褐色，而在 WT 对照的果皮上没有观察到（图 1e)。

使用 HPLC 的化学分析表明，转基因果皮中儿茶素、表儿茶素、原花青素和 cyandin-3-galactoside 的水平显着降低（图 S2a、b、c、d）。苹果中主要的花青素 cyandin-3-galactoside 的减少与红色的减少是一致的。相反，根皮苷和绿原酸的水平显着增加（图S2e，f）。总之，果皮颜色和化学成分的变化表明miR172的表达升高抑制花青素生物合成并增加其他类黄酮化合物的水平。

3.2 miR172转基因苹果植物中花青素生物合成基因的表达受到抑制

为了揭示miR172过表达如何改变基因表达，使用从成熟果皮 (FS) 中分离的 mRNA 进行转录组分析。4383 个基因显着上调，2903 个基因显着下调。在这些差异表达基因（DEG）中，2411 个基因被上调，1687 个基因被下调超过两倍。苹果基因组包含 8 个具有 miR172靶序列的AP2基因。使用这些基因和六个拟南芥对应物的蛋白质序列进行的物候分析表明，苹果基因被分为 4 个不同的进化枝。8个苹果基因中，MdAP2_1a（MD15G1286400 ）与拟南芥AP2关系最密切，表达水平最高，而MdAP2_1b和MdAP2_2a 表达水平极低，其余5个基因（MdAP2_2b、3a、3b、4a和4b ）在 WT 和miR172OX苹果植物的 FS 组织中不表达（图 1f）。

MdMYB10是苹果果皮中的关键花青素激活剂。MdMYB10的转录水平在miR172OX 果皮中显着降低。通过 RT-PCR 分析证实了MdMYB10表达的这种强烈降低（图 S5a）。除 MdMYB10外，与 WT_FS 相比，miR172OX_FS 中的花青素生物合成途径基因也显着下调（图 1g，图S5）。

3.3 miR172通过抑制拟南芥中AP2的表达来抑制类黄酮的生物合成

由于稳定转化苹果植物和种植植物产生果实很慢，我们选择拟南芥植物来进一步表征miR172在调节类黄酮生物合成中的功能。为了测试miR172是否抑制拟南芥中的类黄酮生物合成，使用苹果miR172 过表达构建体转化了拟南芥植物，因为miR172及其靶向位点在植物物种中高度保守。70 株独立的拟南芥T1 转基因植物中的 6 株含有miR172，使用RT-PCR分析基因构建体以确定miR172水平。选择具有高 miR172表达水平的三株植物以产生T3代纯合转基因植物。当在含有 7% 蔗糖的组织培养基中生长时，这三个 T3 系的植物没有显示出红色，而 WT 植物由于花青素积累而明显显示出红色。（图 2a、b）。与野生型植物相比，转基因植物的黄酮醇水平也显着降低（图 2c）。相比之下，转基因植物显示出早期开花表型，这与以前的研究结果一致。在WT植物的叶子中，miR172的表达水平极低，但在三个转基因株系的叶子中显着增加（图 2d）。相比之下， AtAP2表达水平在两个转基因株系中呈现下降趋势，在一个株系中显着下降。（图 2e）。与WT对照植物相比，转基因植物中花青素和黄酮醇生物合成途径中调节和生物合成基因的表达水平也显着降低。生物合成途径基因 ( AtDFR , AtANS , AtUFTG和 AtFGT1 ) (图 2f-n）。该结果表明miR172过表达抑制拟南芥中类黄酮的生物合成，这与miR172在苹果中过表达的结果一致。

3.4 AP2同源物正向调节花青素的生物合成

为了为调节花青素生物合成的AP2 样基因提供直接证据，我们选择在烟草“NC89”中过表达MdAP2_1a 。选择“NC89”是因为它开出的花朵带有淡粉色的花瓣。我们用CaMV35S-MdAP2_1a基因构建体生产了 29 株转基因烟草植物，并通过 RT-PCR 分析鉴定了至少 4 株表达MdAP2_1a的植物（图 S8）。与 WT 对照植物相比，OE#22 和 OE#24 的花瓣在未开放的花朵中呈现出较早的红色，而在已开放的花朵中呈现出更强的红色(图 4a）。这些转基因植物在花瓣中的花青素积累水平显着高于野生型植物（图 4b）。这些增加的红色和花青素含量与MdAP2_1a转基因的表达水平相关（图 4c）。我们对 WT、OE#22 和 OE#22 烟草花瓣中的花青素生物合成和调控基因进行了 qRT-PCR 分析。结果显示烟草MYB调节因子NtAN2的表达水平显着升高（图 4d)，两种烟草 bHLH 调节剂 NtAn1a , NtAn1b (图 4e-f) 和烟草花青素生物合成途径的基因，包括NtCHS、NtCHI、 NtF3H、NtF3'H、 NtDFR、NtANS和NtUFGT (图 4g-m）。总之，这些结果表明，AP2 样基因可以通过增加花青素生物合成和调节基因的转录来增强花青素生物合成。

为了确定MdAP2_1a表达的敲低是否可以减少花青素的生物合成，我们使用病毒诱导的基因沉默 (VIGS)沉默了 MdAP2_1a 。在农杆菌将 MdAP2_1a 的 VIGS 载体渗入苹果品种“金秀红”的果实中15 天后，渗入部位周围的红色显着减少。然而，当使用空 VIGS 构建体作为对照时，浸润部位没有明显减少（图 S9a）。RT-PCR 分析显示 VIGS 降低了MdAP2_1a转录水平，并且还导致MdMYB10和 MdUFGT表达水平降低（图 S9b）。

MdAP2_1a VIGS 构建体也用于敲低樱桃中的AP2表达，因为 VIGS 构建体中使用的 345 bp 的 MdAP2_1a编码序列与樱桃同源物PavAP2 共享相同的序列。VIGS 载体侵染后，甜樱桃“Summit”的果实显示出红色减少（图 S9c ）和PavAP2、PavMYB10和 PavUFGT的表达水平（图 S9d）。这些结果，连同 MdAP2_1a的结果在转基因烟草植物中的表达，表明AP2同源物是花青素生物合成的正调节剂。

3.5 MdAP2_1a 通过与 MdMYB10启动子的相互作用增强花青素生物合成

由于 MdMYB10 是苹果花青素生物合成的关键调节因子，我们进行了酵母双杂交 (Y2H) 和双分子荧光互补 (BiFC) 实验来检验 MdAP2_1a 可能与 MdMYB10 相互作用的假设。Y2H 分析表明，包含两个 AP2 结构域 (MdAP2_1a 182-338 ) 或 MdAP2_1a 的 C 末端 211 个氨基酸 (MdAP2_1a 339-549 ) 的全长蛋白质和片段可以与 MdMYB10 蛋白相互作用（图 5a-c）。这种 MdAP2_1a 与 MdMYB10 的相互作用通过免疫共沉淀 (Co-IP) 测定和 BiFC 实验得到证实（图 5d, e）。综上所述，这些结果表明 MdAP2_1a 可能与 MdMYB10 蛋白相互作用以调节苹果花青素的生物合成。

总结

尽管miR172已在许多植物物种中进行了功能研究，但其在类黄酮生物合成中的作用之前尚未研究过。在这里，证明miR172通过抑制 AP2 负调节苹果和拟南芥中黄酮类化合物，包括花青素的积累。MdAP2_1a 是通过与MdMYB10启动子及其蛋白质序列直接相互作用来调节花青素积累的正向调节剂。这些发现建立了一个新的 miR172-AP2-MYB10 类黄酮积累调控网络（图 7）。

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原文链接：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8846330/

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