多疗程40Hz tACS对阿尔茨海默病患者海马灌注的影响

背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)与认知障碍相关的皮质灌注改变有关。最近，gamma带的神经活动被认为是小动脉血管运动的驱动因素，而另一方面，在AD临床前模型上的gamma活动诱导已被证明可以促进蛋白质清除和认知保护。

方法：在两项开放标签研究中，我们评估了15名轻度至中度AD患者通过40Hz (gamma)经颅交流电刺激(transcranial alternating current stimulation, tACS)调节大脑灌注的可能性，该刺激每天1小时，持续2或4周，主要靶向颞叶。在基线和干预后立即进行灌注敏感MRI扫描，同时进行电生理记录和认知评估

结果：没有任何参与者报告严重的不良反应。动脉自旋标记MRI显示tACS治疗后双侧颞叶血流灌注明显增加。此外，灌注变化与情景记忆的变化和gamma带谱功率的变化呈正相关。 结论：40Hz tACS作为一种安全、无创的干预措施，应在更大规模的安慰剂对照试验中进一步研究，以增加AD患者脑快速振荡活动和关键脑区灌注。本文发表在Alzheimer’s Research & Therapy杂志。

背景

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是痴呆最常见的病因，其患病率持续增高。尽管有巨大的疾病负担和密集的科学研究，但治疗选择有限。虽然有药物干预可以暂时稳定认知功能，但没有疾病修饰疗法(disease-modifying therapy)可用。甚至有前景的药理干预(例如，抗淀粉样蛋白化合物aducanumab)似乎不能阻止认知能力下降。为了开发有效的治疗方法，研究集中在加深我们对AD病理生理学的理解上。正电子发射断层显像(Positron emission tomography, PET)和单光子发射计算机断层扫描(single-photon emission computed tomography, SPECT)显示，与健康对照组相比，AD患者存在明显的低代谢和灌注缺陷。最近，一种灌注敏感的MRI成像序列——动脉自旋标记(arterial spin labeling, ASL)，已经被开发用于研究脑灌注，而不需要对比剂。ASL帮助揭示了与健康受试者相比，AD患者颞叶、顶叶和后扣带回皮质的脑灌注(脑血流量(cerebral blood flow, CBF)显著减少，还描述了该疾病临床前阶段的病理性血流量增加。此外，在AD患者中，CBF降低与语言障碍相关，并且其降低与前驱期开始的疾病进展相平行。此外，低灌注也可预测轻度认知障碍(mild cognitive impairment, MCI)患者转换为AD，因此寻求调节(即增加)灌注的方法成为优先考虑的问题。

最近的一项临床前动物研究表明，gamma (γ)带的脑振荡活动直接导致小动脉血管扩张，并随之增加血氧合。Gamma活动通常是指30-80Hz频带的皮层振荡，主要是由抑制性中间神经元(如小白蛋白(parvalbumin, PV)+中间神经元)与锥体细胞之间的相互作用产生的。研究人员发现，γ波段电功率的光遗传操纵以一种单向的方式(即独立于基线CBF)带动相应皮层和穿透性小动脉的血管舒缩振荡。反过来，小动脉直径的波动又驱动血氧饱和度的波动。电活动以2秒的延迟驱动小动脉血管收缩，进而导致一秒后功能MRI信号的变化(检测到静脉成分氧合增加；BOLD信号)。这种微动脉电耦合的意义与血管舒张通过血管旁间隙(即所谓的胶状淋巴系统)清除废物和有毒蛋白的作用有关，该系统在AD小鼠模型和AD患者中似乎受到了损害。

关键的临床前研究也表明，在AD小鼠模型中，外源性诱导的gamma振荡(特别是在40Hz时)增加促进小胶质细胞激活，并导致随后的Aβ和p-tau沉积减少。AD小鼠模型中γ活性降低与PV+抑制性中间神经元病理相关，该病理干扰皮层回路中的快速抑制回路，并与锥体细胞过度激活相关，导致整体网络功能障碍。值得注意的是，在症状前AD小鼠中诱导gamma活性，从而恢复PV中间神经元的生理活性，可以防止随后的神经退行性变和行为缺陷。正如在临床前模型中所看到的，在AD患者中一致发现的是gamma活动相对衰减和失调，因此gamma诱导可能代表了一种新的强有力的治疗方法。

最近，一种传递交流电刺激的神经调控技术——经颅交流电刺激(transcranial alternating current stimulation, tACS)——因其可能通过无创诱导gamma活动将上述动物证据转化给人类而受到关注。tACS应用低振幅交变(正弦)电流，通过在特定皮层节律下夹带神经元来增强特定的振荡，这取决于所应用的刺激频率(如40Hz)。非人类动物研究表明，tACS夹带广泛皮层区域中的神经元，最近的非人类灵长类动物实验表明，剂量依赖的神经夹带和增加的突发性(burstiness)是tACS的基本反应。基于脑电图(electroencephalography, EEG)的实验证据，模拟计算表明tACS通过网络共振调节大脑振荡活动，这表明在共振频率上的微弱刺激可能导致网络活动的大规模调制，并以特定频率的方式放大内源性网络振荡。因此，人们发现tACS能够调节健康受试者和患者的大脑振荡和相关行为，通过tACS增强gamma振荡，导致健康对照组运动、工作记忆和抽象推理任务的短暂改善，效果通常会持续到tACS应用期之后。

在目前的初步研究中，鉴于AD患者gamma活性受损的证据，以及通过gamma夹带恢复脑灌注的潜力，我们的目的是将上述40Hz gamma刺激在AD动物模型中的临床前结果转化到人类身上，方法是将tACS应用于15名轻度至中度AD患者。我们假设，多天的tACS疗程会导致tACS靶向区域CBF的增加，对于接受更长时间tACS治疗的参与者有更强的影响。此外，我们假设CBF变化与研究中使用的不同tACS电极蒙太奇(montage)相关，并可能与EEG测量的gamma功率变化、表征颞叶/海马功能的情景记忆分数产生共变。

方法被试和实验设计

共纳入15例轻度至中度AD痴呆患者(平均年龄72岁，男性9例；简易精神状态检查[Mini-Mental State Examination]- MMSE = 23.53, SD = 3.35)。参与者参加了两个独立的开放标签临床试验，探索不同tACS剂量(即刺激次数)和靶向方法(即tACS电极在头皮上的位置和在大脑中产生的诱导电场)的影响。受试者在医院环境中接受2或4周(周一至周五)每天1小时的tACS，并进行基线(tACS前)和随访(tACS后)评估，包括认知和记忆测试、EEG和灌注MRI (ASL)数据。受试者在tACS前后进行了额外的评估，这些评估未在本论文中报道，也超出了本研究的范围，例如，Aβ和p-tau的PET成像、经颅磁刺激(transcranial magnetic stimulation, TMS)测量、TMS-EEG联合记录、语音生物标志物记录、血液生物标志物。

根据tACS范式的不同，被试可以细分为三组：

(i)接受2周(10次治疗= 10h)的单侧颞额叶tACS(组1；n = 5)；

(ii)接受2周(10次治疗= 10h)的双颞tACS(组2；n = 5)；

(iii)接受4周(20次治疗= 20h)的双颞tACS(组3；n = 5)(图1)。

蒙太奇中刺激的共同部位是右颞叶(图1)。在tACS干预前和干预后的1周内，参与者接受了认知评估、64通道头皮EEG和MRI评估。所有参与者在参与研究前都提交了书面知情同意书。

图1实验方案

A. 研究设计及相关的tACS前后测量。

B. 左侧为接受单侧颞额叶tACS的代表性受试者(组1)的正常电场(En-field)，右侧为接受双侧颞叶刺激的受试者(组2和组3)。

首个试点试验NCT03290326旨在评估AD患者实施两周tACS刺激治疗的安全性和可行性。在入选的前10名患者中(组1和组2)，第一组患者接受了以颞额叶为中心的个性化右侧刺激。其原理是基于Florbetapir PET成像的个体Aβ累积图进行个性化刺激。在组1参与者中，靶向Aβ负载高的右侧颞叶和额叶，考虑到Aβ负荷高于额叶，颞叶的tACS强度更强(图1)。这种方法导致组1受试者右侧颞额叶接受刺激；然而，根据淀粉样蛋白负荷的分布(即X患者EEG电极位置F4和T8的最大电流密度，Y患者F2和T8的最大电流密度)。单侧个体化刺激可检测tACS刺激对AD大脑单个靶区的空间特异性，改善治疗期间和/或治疗后发作/EEG变化的定位和/或识别(即更有可能在受刺激的右半球)。考虑到前5名患者(组1)实现了非常好的空间定位，在电生理和临床评估中没有检测到癫痫样改变，研究人员决定刺激组2双侧，特别是颞叶。

考虑到AD大脑中典型的Aβ和tau蛋白分布，双颞叶tACS被认为是一种诱导颞叶更多局部刺激的方法。此外，tau蛋白，特别是在颞叶中表达的tau蛋白，也与AD患者的认知能力下降显著相关，而Aβ的相关性较弱或为零。因此，对颞叶的重视可以保证未来对tau积聚的潜在调节几率更高，同时也可以靶向AD患者同一区域出现的低灌注。最后，在第三组对应的NCT03412604试验中，双颞刺激4周，以提高诱导灌注和蛋白改变的概率，同时测试4周刺激方案的安全性和可行性。根据《赫尔辛基宣言》的原则，当地伦理委员会批准了研究提议和相关方法。

经颅交流电刺激(Transcranial alternating stimulation, tACS)

tACS(Starstim SS32, Neuroelectrics)包含电池驱动的电流刺激器，表面圆形Ø 20mm PISTIM电极，电极带有Ag/AgCl核心和3.14 cm2的凝胶/皮肤接触面积。电极被放入与国际10/20 EEG系统相对应的氯丁橡胶帽孔中。凝胶被用于优化信号导电性和降低阻抗。在开始每次tACS治疗前都检查电极阻抗，以确保刺激的安全性和最大有效性，并确保参与者熟悉tACS诱导的头皮感觉(如刺痛)。在所有的疗程中，32个电极被放置在头皮上记录每次tACS前后的EEG，尽管只有一小部分电极用于传递tACS。tACS以40 Hz的刺激频率刺激1 h，每个电极上最大刺激强度为2 mA，所有电极总强度为4 mA，刺激开始后先是30-s的上升期，刺激结束前是30-s的下降期，同时研究和临床人员在每个疗程的整个过程中仔细监测副作用。所有患者蒙太奇的共同刺激部位由T8(10/20 EEG系统)定位的右侧颞叶代表。考虑到长时间的刺激过程和特定的患者群体，在tACS过程中，参与者被要求观看一系列预先选定的视频剪辑，这些视频是从YouTube上免费提供的精选纪录片中挑选出来的，目的是保持恒定的大脑状态，同时减少分心，避免与操作人员在房间里的持续互动。研究团队根据视频长度(即1小时左右)、主题(即不包括可能引起参与者过度兴奋和激活的战争或其他冲突主题的纪录片)和语言(即不包括那些技术/特定术语)来选择视频。这些主题在不同类型之间相互平衡，以提供一个很好的视频选择，既能吸引参与者，又能集中他们的注意力(视频片段的主要目标)，同时也适合有不同偏好的患者(例如，关于动物、自然、历史、技术以及电影制作和音乐的纪录片)。每天患者都被要求从列表中选择，或者继续上一个tACS治疗期间播放的视频。

生物物理建模

考虑到参与者皮层萎缩的预期变化，我们没有对第一组参与者使用固定蒙太奇(电极位置和电流)，而是定义了一个皮层靶点，旨在保持正常电场(En-field)振幅固定在最高Aβ沉积区域，试图确保参与者接受类似的电场剂量。由于刺激器可以输出的电流和不同靶点大小的限制，仍然观察到一些变化。最终的蒙太奇包括8个刺激电极，根据当前的tACS安全指南，在每个电极上提供40Hz的tACS，最大强度为2mA，并且由于Aβ分布，在颞叶上产生更高的感应场。在第一组中，tACS所有电极不是同相的，因为仅获得同相刺激是不可能的(电流守恒)。对每个区域的目标相位进行优化，使PET定义的靶点上的诱导场最大，从而得到区域间180相位。通过融合PET和MRI数据来确定最佳刺激靶点的方法是由研究的PI开发的；PI与Neuroelectrics团队合作，使用Stimviewer算法和文献中描述的方法，对tACS进行了个性化蒙太奇计算。

第二组和第三组的刺激模板遵循相同的安全指南，但刺激通过4个固定刺激电极(P8、T8、P7和T7，右侧电极相对于左侧电极以180°相位输送电流)对双侧颞叶进行刺激，这是因为当患者出现症状时，Aβ和tau蛋白沉积通常累及双侧颞叶(图1B)。第二组和第三组双颞tACS的电极位置和刺激强度由研究的PI定义。根据经颅电刺激(transcranial electrical stimulation, tES)在颞区传递时所报告的典型不适，对每个患者的刺激强度进行滴定。在tACS治疗前一周和治疗后一周采集完整的64通道静息态EEG，并进行全面的神经认知评估。

MRI扫描

神经成像采集在一台GE 3Tesla MR750扫描仪上进行，使用Nova Medical公司的32通道头部阵列线圈。受试者接受高分辨率T1加权结构扫描(3D T1-w BRAVO)、2次静息态功能连接、静息灌注MRI ASL、弥散张量成像、T2*GRE和FLAIR序列(总扫描时间60分钟)。ASL研究采用3D伪连续标记(1.45s标记，2.025s标记后延迟)、背景抑制和32个中心有序4mm厚切片进行。

ASL预处理和分析

ASL数据预处理基于MATLAB和SPM12完成。通过DARTEL对3D T1w BRAVO图像进行灰质、白质、CSF三类分割并归一化处理。将ASL减影图像联合配准到灰质图，归一化到MNI152空间。用SPM12的颅内容积(Intracranial Volume, ICV)掩模(mask)遮盖归一化CBF图，并对CBF值进行全局归一化。在刺激前和刺激后两个时间点，手动掩模每个CBF图和分割步骤得到的相应标准化灰质掩模。灰质CBF图在6 mm半高全宽(full width at half maximum, FWHM)处进行平滑处理。

为了检查灌注MRI数据质量，并检查参与者颞叶CBF是否符合预期值(对于AD患者的灰质，通常约30毫升/分钟/100 g)，使用SPM12嵌入的REX工具箱(https://www.nitrc.org/projects/rex/)提取单个被试颞叶CBF值。通过对所有参与者(n = 15；单体素水平p<0.001，簇水平p<0.05, FDR校正)以及每组参与者进行配对t检验，在SPM12中对标准化灰质CBF图进行纵向统计分析，评估tACS的影响。在全脑水平上进行分析，以确保所观察到的CBF变化不会因选择特定的感兴趣区域而放大。在确定灌注发生显著变化的情况下，显著簇内的CBF变化与情景记忆和语言测试中的变化(Δ=后-前)以及通过EEG测量的tACS后的gamma谱功率变化相关。最后，使用SPM Anatomy工具箱通过概率图谱标记提取的重要簇(见表1)。

表1所有受试者灌注的显著变化

在分析所有受试者和接受4周tACS干预的第3组受试者的全脑皮质CBF变化(后>前)时检测到的显著CBF变化的解剖图和聚类坐标。

EEG记录和分析

通过actiCHamp EEG放大器系统在tACS治疗前一周和治疗后一周采集全脑64通道静息态EEG。当受试者坐在半倾斜的扶手椅上时，进行EEG记录。在记录过程中，参与者被要求保持安静，面部肌肉放松。考虑到特定的研究人群，特别注意确保参与者理解在记录过程中保持安静的重要性。受试者和EEG都被监测是否有睡意迹象，受试者被要求眨眼几次，并被提醒保持清醒。以1Khz的采样率进行记录，记录期间阻抗保持在5KΩ以下。

数据预处理使用EEGLAB 2020、Fieldtrip工具箱、Brainstorm suite以及Matlab R2017b脚本。首先利用主成分分析(principal component analyses, PCA)将数据缩减为60维，以减少过拟合和噪声成分。带通滤波器采用1-100Hz的前向后向四阶Butterworth滤波器，使用58-62Hz的陷波滤波器，然后将数据参考到全球平均值。随后，进行独立分量分析(independent component analysis, ICA)，人工去除所有剩余的伪迹成分，包括眼动/眨眼、肌肉噪声(EMG)、单电极噪声、心跳(EKG)和听觉诱发电位。最后，使用32个球面插值对缺失/移除通道的数据进行插值。

考虑到纵向CBF变化主要涉及双侧颞叶，特别是右前颞叶，gamma谱功率的变化主要集中在指示双侧颞叶(即T8、P8、P7、T7)的tACS电极阵列上，以及T8电极作为右前颞叶和tACS蒙太奇的共同刺激电极。此外，考虑到AD患者EEG活动放缓，随着theta和delta波段活动谱功率的增加，快速振荡(如beta和gamma)的减少，统计分析集中于检测gamma谱功率的电位变化以及谱频率分布变化的迹象(例如，gamma恢复和/或慢振荡活动的减少)。此外，考虑到有限的样本量和研究的探索性，我们选择了一个更简单的统计框架，而不是全面的重复测量方差分析。具体来说，每个频带的纵向变化通过从tACS后的绝对值中减去基线的绝对谱功率值来量化(例如，基线theta减去tACS后theta)。计算单因素“频率”的单因素方差分析，比较每个频带的前后差异(alpha水平= 0.05)。一旦发现主效应，对频带的事后比较也会被计算出来。EEG频带定义为delta (1-4Hz)、theta (4-8Hz)、alpha (9-13Hz)、beta (14 -30Hz)、低gamma (35-45Hz)、窄gamma (38-42Hz;中心刺激频率为40Hz)、中gamma (45-60Hz)和高gamma (60-90Hz)。第2组中1名参与者未完成tACS后EEG评估；研究人员对14名参与者进行了分析。

认知评估

参与者接受了评估整体认知能力的特定测试(阿尔茨海默病评估量表-认知亚量表(Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale, ADAS-cog)；MMSE，蒙特利尔认知评估(Montreal Cognitive Assessment, MoCA)，日常生活活动(activities of daily living, ADL))，以评估tACS后整体认知功能的任何潜在变化。此外，使用国家阿尔茨海默病协调中心统一数据集(National Alzheimer’s Coordinating Center Uniform Data Set, NACC UDS)神经心理学组：Craft Story 21即时回忆和延迟处理情景记忆，类别流利性任务(动物)，评估与tACS刺激的大脑区域相关的认知功能。

结果

15名参与者完成了研究，并耐受了干预措施，只有tACS文献中常见的轻微副作用：刺痛(10/15)被评为轻度；头皮刺激(7/15)被评为轻度-中度；刺激帽机械压力引起的视觉变化(8/15)被评为轻-中度，头痛(5/15，被评为轻-中度)。参与者参加了95%的研究访问(190/200次每日tACS访问，总共错过了10次，分布在7例患者中)，显示出良好的治疗依从性。在电生理和临床评估中没有发现癫痫样改变。

灌注变化

所有参与者在基线时(tACS干预前)计算的右颞叶平均CBF值为32.3 mL/min/100g (SD = 6.8)，与AD患者低灌注的文献一致，并验证了图像采集和CBF提取程序。干预后右侧颞叶CBF值由32.3显著升高至34 mL/min/100g(SD = 8.5) (t = 2.01, p < 0.05; Cohen’s d = 0.22)。对第2组和第3组(n=10)接受双颞叶tACS的患者提取左颞叶的CBF值，显示基线时平均值为33 mL/min/100g (SD = 6.5)，干预后的平均值为34 mL/min/100g (SD = 6.4) (t = 1.24, p = 0.11)。第1组接受个性化右颞额叶刺激，提取右额叶的CBF值，显示基线CBF为35.5 mL/min/100g (SD = 9.7)，干预后为39 mL/min/100g (SD = 14) (t =2.36, p = 0.35; Cohen’s d = 0.29)。

除了标准的区域CBF评估外，还进行了全脑体素分析，没有预先指定mask，以保证更公正的结果。当比较所有受试者tACS后CBF图和tACS前CBF图时，右侧颞叶的多个解剖簇均检测到显著的CBF增加(n=15，图2A) (p<0.05, FDR校正)，尤其是右侧内侧颞极、梭状回和内嗅皮层(概率解剖定位和簇坐标见表1)。值得注意的是，这一结果与15名参与者中唯一被持续刺激的右颞叶是一致的。

图2灌注结果

A. tACS后CBF增加。配对t检验(后>前, p<0.05, FDR校正)显示，右颞叶脑血流选择性增加，代表了刺激的共同部位(n = 15)。

B.接受最高剂量tACS (4周内双侧颞叶刺激20h, n = 5,组3)的参与者的全脑CBF分析显示，根据刺激模板，双侧颞叶的CBF选择性增加(p<0.05, FDR校正)。

C.第二组和第三组的两个代表性参与者的CBF变化的例子。

将被试按tACS蒙太奇分组，观察tACS前后CBF的变化，颞额叶(组1)和双颞叶(组2和组3) tACS蒙太奇均可导致CBF的显著变化，但两组被试局部CBF的增加呈现不同的脑地形图：组1 (右侧颞额叶tACS；图3 A)；组2-3(双颞tACS；图3B)。

图3 tACS蒙太奇组间CBF增加比较

A.当观察第1组接受右颞额叶刺激的参与者tACS后显著的CBF增加时，发现了一种主要的右颞额叶CBF增加的模式，与tACS靶向相匹配。

B.组2 + 3 (n = 10)接受双侧颞叶刺激的受试者CBF显著增加，主要集中在双侧颞叶区域。

此外，第3组(接受最长的双颞叶干预，即4周20 h，组1和2为10 h) CBF增加的一个重要模式主要涉及双边颞叶，包括内侧颞极、梭状回、双侧嗅内皮层和海马(概率解剖映射和簇坐标见表1)，匹配双颞tACS蒙太奇(t = 2.13, p<0.05, FDR校正；图2B)。

tACS刺激后EEG改变

对T7/8-P7/8簇的单因素方差分析显示(双颞叶刺激)，与其他频谱相比，tACS对刺激频率附近的频谱功率(即窄gamma，38-42Hz)有影响(F(7,78)= 4.12, p < 0.05; η2= 0.03)(图4)。事后分析显示，tACS刺激后窄gamma谱功率的增加高于theta波段(t = 3.43, p < 0.01 Cohen’s d = 0.031)、beta波段(t = 2.37, p < 0.05;Cohen’s d = 0.026)和高gamma带(t = 1.84, p < 0.05 Cohen’s d = 0.024)(图4A)。对T8电极(两组间刺激的共同部位)进行同样的分析，在不同频率上tACS刺激前后的变化分布相似，窄gamma和theta波段tACS前后变化差异显著(t = 2.06, p < 0.05; Cohen’s d = 0.025)。虽然其他gamma频率子带也表现出和窄gamma相似的趋势，但其他比较不显著。

图4 CBF变化、EEG结果及与认知的相关性

A.显示tACS后灌注增加的一组EEG电极(T8、P8、P7、T7，左图) gamma波段功率变化，T8电极(右图)代表所有参与者共同的tACS电极，头皮电极更靠近右侧颞叶，显示tACS后CBF的变化最高。

B. T8上检测到的窄gamma带(38-42 Hz)谱功率变化与右侧颞叶CBF变化显著相关(左图)。

显著的CBF变化也显示了与tACS前后的记忆性能分数变化的显著相关性。具体而言，所有参与者(n=15)右颞区CBF的变化与情景记忆任务中复述(中间图)和逐字(右图)回忆部分的表现变化呈正相关。在T8上观察到的窄gamma谱功率变化与右侧前部颞叶CBF的增加显著相关。具体而言，T8上窄gamma谱功率的变化与在所有可用参与者中提取的CBF显著增加的簇显著相关(总数= 12；1名被试未完成tACS后EEG评估，剔除2个异常值) (r = 0.57; p = 0.05; R2= 33%，图4B)。

认知与灌注的纵向相关性

tACS治疗后总体认知无显著性改变(p > .05) (ADAS-Cog基线均值= 18.27，SD = 7.68，治疗后均值= 18.11，SD = 7.69，Cohen’ s d = 0.02；ADL基线均值= 68.5，SD = 4.68，治疗后= 68.3，SD = 6.23，Cohen’ s d = 0.03；MMSE基线平均= 23.53，SD = 3.35，治疗后= 22.77，SD: 3.68, Cohen’s d = 0.21；MoCA：基线平均= 15.73，SD = 4.23，治疗后= 17.53，SD: 4.5，Cohen’s d = 0.41)。记忆和语言测试方面的变化没有达到显著性(p > 0.05): Craft Story即时回忆(Verbatim:tACS刺激前平均= 8.13，SD = 3.71；tACS刺激后平均= 7.93, SD = 5.83, Cohen’s d = 0.04)，Paraphrase(tACS刺激前平均= 6.93，SD = 3.77；tACS刺激后平均= 6.80, SD = 4.1, Cohen’s d = 0.03)；Craft Story延时回忆(Verbatim:tACS刺激前平均= 3.87, SD = 3.64，tACS刺激后平均= 5.20, SD = 5.43, Cohen’s d = 0.28;Paraphrase: tACS刺激前平均= 3.87, SD = 3.35，tACS刺激后平均= 4.93, SD = 4.3, Cohen’s d = 0.27)；类别流利度(动物，总正确数，tACS刺激前平均= 11.47, SD = 5.43；tACS刺激后平均= 11.33, SD = 4.6, Cohen’s d = 0.02)。

显著的CBF变化与Craft Story延迟回忆的变化呈正相关(图4C)。具体而言，从tACS后显示出显著纵向CBF变化的区域提取的ΔCBF值(tACS刺激后CBF值与刺激前CBF值之差)与Craft Story延迟回忆Verbatim (r = 0.53, p = 0.04, R2= 0.29)、Paraphrase (r = 0.60, p = 0.01, R2= 0.36)变化(后减前)呈正相关(图4C)。

讨论

我们的数据表明，多疗程gamma tACS会导致颞叶CBF的显著增加，而没有副作用。具体来说，当分析所有参与者的全脑皮质CBF时，右颞叶显示出显著的增加，该区域在所有参与者中都受到了持续的刺激，包括内嗅皮层(图2)。此外，当将分析限制在接受双侧颞叶刺激4周(tACS最高剂量)的参与者时，观察到左右颞叶CBF显著增加，包括其近中部和海马(图2)。在比较两种不同刺激模板获得的灌注变化时，观察到tACS靶点特异性参与(engagement)的初步证据(图3)。最后，发现gamma谱功率变化与CBF增加相关(图4)，并且与情景记忆和流利性相关认知表现的变化适度相关(图4和图S1)，这两个认知域功能位于颞叶，在AD患者中通常受损。尽管低代谢/灌注在AD病理生理学级联反应中的因果关系尚不清楚，研究结果为AD患者和其他以低灌注为特征的疾病开辟了潜在的有趣途径，同时部分阐明了与gamma介导的淀粉样蛋白和tau清除相关的最新临床前证据的潜在影响。

据我们所知，只有两项研究报告了接受药物治疗(如多奈哌齐)的AD患者局部CBF增加。目前的初步结果支持最近gamma活动在AD病理生理学中的相关性，同时也为最近记录的gamma活动在人脑血管直径变化中的因果作用提供了潜在的证据。虽然gamma活动已经被发现是动物小动脉血管运动的驱动因素，但是将神经元尖峰转化为小动脉直径变化的分子/生物学机制尚未完全阐明。临床前期(preclinical)模型tES研究的最新观察结果表明，通过血管周围神经元介导和血管内皮介导的途径(例如，作用于硬膜/软膜动脉和穿透小动脉，由主要引起血管扩张的血管周围副交感神经的电流靶向)有可能诱发即时、初级的血管舒张反应；通过神经血管耦合，带动星形胶质细胞和神经元参与，有可能诱发间接、继发性血管反应。值得注意的是，tES通过作用于同一靶点，可引起初级和次级反应。例如，周细胞(pericytes)——包裹在毛细血管内皮壁形成神经血管单位的细胞——根据区域神经元活动调节小动脉和毛细血管直径。除了受刺激细胞本身释放的肽的调节外，tACS还可能导致周细胞和星形胶质细胞的间接调节，这是直接神经元调节的结果。

在病理生理水平上，CBF的变化是脑葡萄糖代谢变化的结果，CBF的下降被认为是突触衰竭的反映。事实上，突触缺失被认为是支撑认知能力下降的最重要和最直接的现象，最终导致了网络中断。在这个框架内，同时考虑到小动脉对胶状淋巴系统通路的贡献，40Hz tACS可以通过调节导致整体网络功能障碍的中间神经元活动，并通过激活小胶质细胞废物清除，和/或通过恢复受损皮层区域的灌注，以保证足够的营养物质和清除有毒产物，来应对AD的病理生理级联。有趣的是，最近tau蛋白的病理与内嗅皮质的低灌注有关，尽管其确切的病理生理机制尚不清楚。最后，其他神经精神疾病与AD中观察到的代谢受损和中间神经元活动减少的细胞基质相同，特别是额颞叶痴呆(frontotemporal dementia, FTD)、精神分裂症和自闭症谱系障碍，这表明tACS也可以使这些患者群体受益(例如，参见NCT04425148，FTD的40Hz tACS)。

至于CBF变化的位置和tACS的剂量-反应效应，我们的数据中观察到良好的空间特异性，主要涉及颞叶。先前的研究表明，AD小鼠模型中，丘脑-海马回路中gamma活动的改变会导致记忆障碍，有充分的证据表明gamma和theta振荡，以及它们的相位互反关系在一般记忆过程中至关重要。特别是，内嗅-海马回路在生理上显著表达gamma振荡，这可能使tACS诱发gamma夹带的可能性在这些区域更合理，即使存在潜在的病理性失同步的gamma活动。需要对更大样本的参与者进行进一步研究，以确定在剂量反应效应方面的最优治疗方案(即，1周的每日刺激后休息，4周的持续治疗)。必须注意的是，高分辨率64通道EEG记录作为基线和随访评估的一部分，在整个治疗过程之前和之后进行。具体来说，这两个研究访问是优先的，因此它们将在治疗之前(即，在随后的周一开始tACS治疗之前的周五)和治疗之后(即，在治疗最后一周后的周一)进行。然而，与剩余研究访问时间安排(如MRI、PET)相关的后勤问题，以及患者的可用性，有时会干扰原计划的时间安排。因此，治疗后出现了gamma振荡活动的延迟评估，这使得观察到的gamma谱功率的变化更有可能代表tACS长期后效应，而不是脑振荡活动的急性变化。未来的研究应包括从最后一次tACS治疗结束开始的多个时间点的纵向EEG评估，以适当地表征个体tACS效应的轨迹。

尽管与药物试验相比，tACS治疗时间较短，但在AD患者或健康对照组中，tACS治疗比任何公开可用的方案都要长——在4周的时间里，最多刺激20小时，因此证实了tACS的安全性以及它在AD患者中的可行性：没有任何不良事件，并且坚持治疗方案。与此同时，与药物试验(如6-12个月)相比，tACS干预时间相对较短，且样本量有限，可能导致干预后整体认知水平缺乏显著变化。的确，发现了MoCA测试的改善趋势，MoCA能够检测到微妙的认知变化，特别是在轻度痴呆阶段(基线平均= 15.73, SD = 4.23，治疗后= 17.53, SD: 4.5)，具有中等效果大小(Cohen’s d = 0.41)。这一结果，以及观察到的tACS刺激后灌注和情景记忆变化之间的相关性，支持需要更长的试验和更大的样本量，以适当地评估tACS潜在的治疗效果，并理清gamma活动、脑灌注和认知表现的变化之间的关系。也应考虑基于家庭的tACS治疗，促进患者的可及性，降低护理人员的负担。

最后，在目前的试验中，我们关注的是轻度到中度AD患者，考虑到他们记录到的gamma改变、低灌注和蛋白病变，从而观察tACS的潜在影响。然而，最近的证据表明，在认知缺陷发病前约15-20年，淀粉样蛋白开始积累，随后出现小胶质细胞增生和神经纤维缠结tau病理，使轻度至中度痴呆成为AD的一个相对晚期阶段，出现了显著的不可逆神经元和突触丧失，治疗对策可能不那么有效。然而，如果被证实有效，tACS可能在疾病的早期阶段，以及前驱期AD (例如，Aβ或Presenilin前体常染色体显性突变的患者)和MCI患者中发挥作用。考虑到tACS的安全性和可移植性，应探索tACS作为临床前预防性干预的潜在应用，延迟症状发作和/或减缓疾病的进程。

局限性

这些试验的目的是作为试点，考虑到参与者样本有限以及多种靶向方法，并不打算在研究的任何方面提供明确的答案。需要更大的样本来证实观察到的CBF的增加以及gamma谱功率的变化，这可能是通过减少每天在医院就诊的次数(例如，使用基于家庭的tACS；目前的试点共包括200个每天的tACS疗程和大约240个基线/随访研究访问)，并在总体上简化研究设计。对照组tACS条件，包括假刺激(安慰剂)和可能的对照刺激频率，也应该包括在内(NCT03880240)，以确保观察到的CBF增加与tACS干预有关，而不是暴露于研究中的非特异性影响(例如，与卫生保健提供者的日常互动)，但考虑到该效应的空间特异性以及轻度至中度AD患者自发局部灌注增加的可能性，不太可能是非特异性影响。

总结：

这项研究对15名轻度至中度阿尔茨海默病患者使用40Hz (gamma)经颅交流电刺激(transcranial alternating current stimulation, tACS)，刺激靶点主要位于颞叶，刺激每天1小时，持续2或4周。动脉自旋标记磁共振成像显示治疗后颞叶、内嗅皮质和海马局部脑血流量增加，且灌注变化与情景记忆的变化和gamma带谱功率的变化呈正相关。研究表明40Hz tACS有临床前景，可能增加阿尔茨海默病患者脑快速振荡活动和关键脑区灌注。

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