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枫香-真菌互作培养体系构建

Method for Constructing Liquidambar Styraciflua-Root Fungus Interaction System

王玉宸^{1, 2}，彭龙^{1, 2}，潘雪玉³，袁志林^{1, 2} *

¹林木遗传育种国家重点实验室，中国林业科学研究院，北京；²中国林业科学研究院亚热带林业研究所，杭州；³中国林业科学研究院热带林业研究所，广州

*通讯作者邮箱：yuanzl@caf.ac.cn

摘要：林木可与真菌形成多种不同类型的关系以适应复杂的生存环境。作为林木-真菌互作研究的常见树种之一，北美枫香 (Liquidambar styraciflua) 是一种优良的抗逆树种选育材料，具有耐干旱、耐瘠薄、萌芽能力强、生长速度快等特点，通过播种繁殖易获得实生苗，经消毒处理后可得到无菌苗用于枫香-真菌互作培养体系构建。此外，北美枫香是优良的彩叶树种，叶入秋变红，是极具生态研究价值及观赏经济价值的造林绿化树种。为了探究枫香-真菌的互作机制及促进枫香适应环境胁迫的效应，需要建立标准的实验室体系互作研究方法。本文介绍了枫香-真菌互作培养体系的构建方法，包括育苗体系和接种方法等。

关键词：枫香，真菌，互作体系

材料与试剂

1.泥炭土

2.珍珠岩

3.蛭石

4.有机肥

5.ddH₂O

6.超纯水

7.WPM粉末 (EKEAR)

8.改良MS培养基 (见溶液配方)

9.20× 大量元素母液 (见溶液配方)

10.100× 微量元素母液 (见溶液配方)

11.100× 铁盐母液 (见溶液配方)

12.100× 有机化合物母液 (见溶液配方)

13.IBA母液 (见溶液配方)

14.0.85%生理盐水 (见溶液配方)

15.0.1%升汞 (见溶液配方)

16.PDA培养基 (见溶液配方)

17.WPM培养基 (见溶液配方)

仪器设备

1.接种针

2.毛刷

3.纱布

4.剪刀

5.镊子

6.滤纸

7.漏斗

8.锥形瓶

9.封口膜

10.移液枪

11.血球计数板

12.打孔器 (直径7 mm)

13.大试管 (38 mm × 250 mm)

14.大培养皿 (直径15 cm)

15.光学显微镜 (Carl Zeiss, model: Axio Scope A1)

16.光照培养箱 (宁波扬辉，model: RDN-1500B)

17.Phytatray^TMⅡ培养容器 (sigma, catalog number: P5929)

18.立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安，model: LDZF-50KB-II)

实验步骤

1.真菌接种剂的准备

1.1菌饼接种剂准备

1)PDA培养基灭菌后取出，室温下放置，待培养基温度约45 °C后，倒入一次性塑料培养皿中，待培养基凝固后，进行接种处理。

2)从纯培养真菌平板菌落边缘用接种针挑取菌块，转移至PDA固体培养基上26 °C黑暗条件下培养。

3)待培养7 d后，自菌落边缘使用打孔器 (直径7 mm) 取菌饼作接种剂。

1.2孢子悬浮液接种剂准备

1)PDA培养基灭菌后取出，室温下放置，待培养基温度约45 °C后，倒入一次性塑料培养皿中，待培养基凝固后，进行接种处理

2)从纯培养真菌平板菌落边缘用接种针挑取菌块，转移至PDA固体培养基上26 °C黑暗条件下培养14 d。

3)制备终浓度为1×10⁶ ml^-1的孢子悬浮液。制备方法如下：取上一步骤中培养14 d的真菌，在其表面倒一层无菌生理盐水 (0.85% NaCl溶液) ，用无菌毛刷轻轻刮取菌丝。以四层无菌纱布过滤并收集滤液；取滤液50 ml，沿着盖玻片边缘滴入血球计数板计数室，使用光学显微镜进行计数；用生理盐水稀释至浓度为1×10⁶ ml^-1的孢子悬浮液作接种剂。

2.无菌北美枫香幼苗的培育

2.1枫香果实成熟期为10-11月份，果穗由绿色转为黄绿色，果实采集后阴干4-7天，然后暴晒数日，用棍打果实即可获得枫香种子 (种子在0-5 °C条件下可贮存5年左右，在-18 °C时贮存时间超过5年) 。将枫香种子播种育苗床。土壤基质及其配比：泥炭土：珍珠岩：蛭石：有机肥=1：2：2：2 (121 °C高压灭菌30 min) ，放置于光照培养箱，保持85%相对湿度，光照条件为14 h光照/10 h黑暗，25 °C恒温培养。

2.221天后，当种子萌发并长成株高3-4 cm的幼苗时 (如图1所示) ，从土壤基质中取出。

图1. 北美枫香实生幼苗培育。图为在育苗床中播种繁殖的枫香实生幼苗，实生幼苗培养条件为：25 °C恒温；85%相对湿度；14 h光照/10 h黑暗。

2.3在超净工作台剪去幼苗根部，将剩余地上部分放入0.1%升汞中进行表面消毒约12 min，再用ddH₂O清洗4-5次去除表面残留升汞。

2.4林木专用生根培养基——WPM培养基 (Woody Plant Medium) 灭菌后取出，室温下放置，待培养基温度约45 °C后，在超净工作台中倒入无菌大试管 (25 ×240 mm) 中，待培养基凝固后，将表面消毒后的幼苗插入培养基 (如图2所示) 。

图2. 枫香幼苗生根培养示意图。图为在装有WPM培养基的无菌试管中进行幼苗生根培养，光照培养箱内生根培养条件为25 °C恒温；14 h光照/10 h黑暗。

2.5将培养有枫香实生幼苗的大试管转移到光照培养箱中，25 °C恒温培养，光照条件14 h光照/10 h黑暗。待实生幼苗重新生根，苗高达到5-6 cm后，可将幼苗取出进行继代繁殖。将每一株幼苗的幼茎剪断，再次插入新的WPM培养基中进行扩繁，转移到光照培养箱中并保持同样的温度和光照条件进行继代繁殖。

2.6选取根系大小、发达程度和株高较一致 (5-6 cm) 的无菌幼苗，进行共培养。

3.实验室体系：枫香无菌幼苗-根系真菌互作体系构建

3.1菌饼接种互作体系构建

1)超净工作台紫外消毒后，无菌Phytatray^TMⅡ培养容器 (长宽高：11.4 cm × 8.6 cm × 10.2 cm) 中倒入70 ml改良MS培养基。

2)将步骤2挑选的根系和株高较为均一的枫香无菌幼苗用镊子将轻轻取出，放入装有ddH₂O的玻璃大培养皿中，洗除幼苗根部的培养基残留，并用无菌滤纸吸干表面水份后，转接至装有改良MS培养基的Phytatray^TMⅡ无菌培养容器内。

3)分为对照组和处理组，每组设置至少3个重复，每个重复包含10株无菌苗 (如图3所示) 。将步骤1.1中打孔获得的菌饼随机挑取5个均匀转接至根系周围，对照组接种灭菌后的菌饼，用封口膜进行密封，防止污染。而后，转移至光照培养箱中以相同条件继续培养，根据自身实验要求设计共培养时间，然后取样进行生理指标的测定。

3.2孢子悬浮液接种互作体系构建

1)超净工作台紫外消毒后，无菌Phytatray^TMⅡ培养容器(长宽高：11.4 cm × 8.6 cm × 10.2 cm) 中倒入70 ml改良MS培养基。

2)将步骤2挑选的根系和株高较为均一的枫香无菌幼苗用镊子将轻轻取出，放入装有ddH₂O的玻璃大培养皿中，洗除幼苗根部的培养基残留，并用无菌滤纸吸干表面水份后，转接至装有改良MS培养基的Phytatray^TMⅡ无菌培养容器内。

3)分为对照组和处理组，每组设置至少3个重复，每个重复包含10株无菌苗 (如图3所示) 。将步骤1.2中稀释获得的孢子悬浮液用移液枪吸取1 ml接种至根系周围，对照组加入0.85%无菌生理盐水1 ml。而后，转移至光照培养箱中以相同条件继续培养，根据自身实验要求设计共培养时间，然后取样进行生理指标的测定。

图3. 枫香-真菌共培养体系示意图。图为在装有改良MS培养基的Phytatray^TMⅡ无菌培养容器中进行枫香-真菌共培养实验a：接种无菌PDA琼脂块作空白对照组；b：接种长满菌丝的菌块作实验处理组

溶液配方

1.PDA培养基

马铃薯             200 g (去皮煮熟后过滤取汁液)

葡萄糖              20 g

琼脂                15 g

加超纯水至1 L，调pH至7.0，121 °C高温高压灭菌15 min

2.WPM培养基 (Woody Plant Medium)

WPM粉末         2.78 g

蔗糖                20 g

琼脂粉               7 g

IBA母液           600 μl

加超纯水至1 L，调pH至5.8，121 °C高温高压灭菌15 min

3.改良MS培养基

20× 大量元素母液    25 ml

100× 微量元素       10 ml

100× 铁盐母液       10 ml

100× 有机化合物     10 ml

蔗糖                 2 g

琼脂粉               7 g

加超纯水至1 L，调pH至5.8 ，121 °C高温高压灭菌25 min

4.20× 大量元素母液

NH₄NO₃           33 g

KNO₃             38 g

CaCl₂·2H₂O        8.8 g

MgSO₄·7H₂O      7.4 g

KH₂PO₄           3.4 g

加超纯水至1 L

5. 100× 微量元素母液

KI                0.083 g

H₃BO₃            0.62 g

MnSO₄·4H₂O      1.69 g

ZnSO₄·7H₂O       0.86 g

NaMoO₄·2H₂O   0.0025 g

CuSO₄·5H₂O     0.0025 g

CoCl₂·6H₂O      0.0025 g

加超纯水至1 L

6.100× 铁盐母液

FeSO₄·7H₂O        2.78 g

Na₂EDTA·2H₂O     3.73 g

加超纯水至1 L

7.100× 有机化合物母液

肌醇                 10 g

IVB 烟酸            0.05 g

盐酸硫胺素          0.01 g

盐酸吡哚醇          0.05 g

甘氨酸               0.2 g

加超纯水至1 L

8.IBA母液

IBA粉末            40 mg

溶于少量无水乙醇，吹打混匀

加60 °C超纯水至80 ml

9.0.1%升汞

升汞                1 g

溶于少量无水乙醇，吹打混匀

加超纯水至1 L

10.0.85%生理盐水

NaCl              8.5 g

加超纯水至1 L，121 °C高温高压灭菌15 min

致谢

本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金青年项目 (31901290) 的经费支持。

参考文献

1.秦媛. (2017) . 盐碱地植物共生微生物资源及功能初步研究. (Master's thesis，中国林业科学研究院) .

2.潘雪玉. (2018) . 沿海防护林树种促生、耐盐根系真菌筛选及机制初探. (Master's thesis，中国林业科学研究院) .

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