Primer设计PCR引物的方法，在线引物设计网站汇总整理
一、PCR引物设计原则
1、引物长度一般在15-30bp。
引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；
2、引物GC含量一般为40%-60%。
引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。
Tm值在72℃左右可使复性条件最佳，至少要在55-80℃之间。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)；
4、引物3’端的碱基一般不用A。
引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。
5、引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
6、引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
7、如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第三位易发生简并，会影响扩增特异性与效率；
8、引物5’端可以修饰。
引物5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
9、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
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