今天为大家介绍的是来自David Baker团队的一篇关于蛋白质设计的论文。设计特定序列的肽结合蛋白质的通用方法在蛋白质组学和合成生物学中具有广泛的应用。然而，设计肽结合蛋白质极具挑战性，因为大多数肽在游离状态下没有明确定义的结构，且必须与肽骨架中的隐藏极性基团形成氢键。在此，受自然和重组蛋白质-肽系统的启发，作者设计由重复单元组成的蛋白质，这些蛋白质与具有重复序列的肽结合，蛋白质和肽的重复单元之间具有一对一的对应关系。作者使用几何哈希来识别蛋白质骨架和肽对接排列，使其与蛋白质侧链和肽骨架之间的双齿氢键兼容。接下来，优化蛋白质序列的其余部分，以实现折叠和肽结合。

许多天然存在的蛋白质家族与具有重复内部序列的肽结合。犰狳重复蛋白与富含赖氨酸和精氨酸序列的延伸肽结合，使得肽中的每个重复单元都适应于蛋白质中的一个重复单元或模块。以前的研究表明，可以重新设计单个蛋白质重复单元的特异性，从而实现对肽序列更广泛的识别。尽管这种方法非常强大，但它仅限于与犰狳重复几何结构相容的肽骨架构象的结合。四联肽重复蛋白与具有各种序列和构象的肽结合，亲和力较低，并且每个肽-蛋白质相互作用记录中都有偏差，这使得为了更普遍的肽识别而进行的工程变得复杂。

方法设计

作者着手将模块化重复蛋白质骨架对肽识别推广到任意重复肽骨架几何形状。这需要解决两个主要挑战：

1. 构建具有与目标肽构象相匹配的重复间距和方向的蛋白质结构；

2. 确保在未结合状态下用肽-蛋白质氢键替换肽-水氢键。

第一个挑战对于模块化和可扩展的序列识别至关重要：如果蛋白质中的单个重复单元将以相同的方向结合到肽上的单个重复单元，那么蛋白质和肽上的重复单元的几何相位必须是兼容的。第二个挑战对于实现高结合亲和力非常重要：在除了α-螺旋和310-螺旋之外的构象中，未结合状态下的NH和C=O基团与水形成氢键，需要在结合时替换成与蛋白质形成的氢键，以避免产生大量自由能损失。

为了应对第一个挑战，作者推断设计蛋白质上的重复单元与肽上的重复单元之间同相位几何匹配的必要条件是两者之间的超螺旋具有对应关系。所有重复聚合物结构都会形成可由三个参数描述的超螺旋：每个重复单元沿螺旋轴的平移；绕此轴的旋转；以及重复单元质心距离轴的距离（半径）（上图a）。作者生成了大量的重复蛋白质骨架，这些骨架覆盖了广泛的超螺旋几何结构。接着，通过随机抽样二肽和三肽构象，然后将其重复4-6次以生成8-18个残基的肽，从而生成相应的重复肽骨架。然后，作者搜索匹配的重复蛋白质和重复肽骨架对，并给出一定数值限制。

为了应对第二个挑战，作者推断蛋白质上的侧链与肽骨架上的一对骨架基团或骨架和侧链基团之间的双齿氢键可以使足够的肽表面区域埋在蛋白质上，从而实现高亲和力结合。由于这种双齿氢键的几何要求非常严格，作者开发了一种几何哈希方法，以便快速识别肽在蛋白质上的刚体对接，这些对接与双齿相互作用阶梯兼容。为了生成双齿侧链-骨架相互作用的哈希表，使用Rosetta能量函数对单个侧链官能团与肽骨架和/或侧链基团进行双齿氢键相互作用的蒙特卡洛模拟，以及由刚体摄动和肽骨架扭转的变化组成的移动集合（上图b）。对于每个接受的（低能量）排列，从功能团构建侧链旋转异构体构象，以识别蛋白质骨架的放置位置，从这些位置可以实现双齿相互作用。结果存储在哈希表中：对于每个放置，从刚体变换以及确定氢键团位置的肽骨架和侧链扭转角度计算哈希键，并将相应旋转异构体的chi角存储在该键的哈希中。

为了确定刚体对接，使重复蛋白质与重复肽之间形成多个双齿氢键，作者利用了以下事实，为使沿着共同轴线的两个超螺旋结构匹配，这里只存在两个自由度，即相对于该轴线的平移和旋转。对于每对重复蛋白质-重复肽，作者在这两个自由度上进行网格搜索，在约1 Å和10°的增量中采样相对平移和旋转（上图c）。对于每个生成的对接，作者计算了每个肽-蛋白质残基对的刚体定向，并查询哈希表以快速确定是否可以进行双齿相互作用，并舍弃匹配数小于设定阈值的对接。对于剩余的对接，在使用哈希中存储的chi角信息构建相互作用的侧链并进行刚体最小化以优化氢键几何形状后，使用Rosetta组合优化来设计蛋白质和肽序列。保持与哈希匹配的残基不变，并在肽和蛋白质的重复序列之间强制序列一致性。

实验表征

作者获取了合成的基因，其中包含了设计的蛋白质，并在大肠杆菌中表达这些蛋白质，其中49个蛋白质中有30个是单体且可溶的。作者将目标肽放置在酵母细胞表面上，通过流式细胞术监测与蛋白的结合。许多设计的蛋白与目标肽序列相似，但亲和力和特异性都相对较低，大多数成功的设计是针对三个残基重复单元。基于这些结果，作者进一步增加设计，提高对肽序列特异性，并且将实验重心集中在三个残基重复单元的肽结合物。设计方案如下：1. 要求肽中的每个非脯氨酸残基与蛋白质发生特定的相互作用，并且与肽两侧发出的侧链相互作用的口袋和沟槽非常明显。2. 在设计阶段之后，评估了所有单个氨基酸改变对肽重复单元的结合能量变化，并仅选择最有利的相互作用的设计。3. 计算丙氨酸扫描来去除不贡献于结合特异性的蛋白质表面疏水性残基，以减少非特异性结合。4.通过Monte Carlo柔性骨架对接计算，选择那些与设计模型非常接近的设计。对第二轮设计的54个蛋白质-肽配对进行评估后，发现42个设计的蛋白质在大肠杆菌中可溶性表达，16个与它们的目标肽的结合亲和力和特异性比第一轮明显更高。作者选择了6个具有不同超螺旋参数和形状进行的例子展示。正如设计模型所示（上图a），蛋白质中的六个重复单元与目标肽中的六个重复单元一一对应（上图b）。图c-e展示了蛋白质折叠成设计目标形态，基本上都是螺旋状并且在95度还有热稳定性，以及六个展示蛋白质中的五个都有至少500s的解离半衰期。

结论

文章的研究表明，通过匹配重复蛋白和重复肽构象的超螺旋参数，并在匹配的蛋白和肽重复之间引入特定的氢键和疏水作用，可以设计模块化蛋白，这些蛋白以高亲和力和特异性地结合到扩展肽上。该策略应该适用于各种重复肽结构，打开了更普遍的肽识别的大门。作者的方法补充了通过重新设计天然存在的重复蛋白来实现普遍肽识别的现有方法；其优点在于通过全新的蛋白质设计，可以生成更广泛范围的蛋白质构象和结合位几何形状，而这不可能通过以天然蛋白质骨架开始。

参考资料

Wu, K., Bai, H., Chang, YT. et al. De novo design of modular peptide-binding proteins by superhelical matching. Nature (2023).

https://doi.org/10.1038/s41586-023-05909-9